嗜水气单胞菌感染大鲵的病理组织学观察

林衍荣,吴 青,黎学练,沙 莎

(1.西南大学动物科学学院,重庆荣昌402460 ; 2.重庆开州水产技术推广站,重庆开州405400)

中国大鲵(Andriasdavidianus)又称娃娃鱼，属两栖类(Amphibian)、有尾目(Urodela)、隐鳃鲵科(Crypt obrachidae)、大鲵属(Andrias)，是我国特有的水陆两栖类动物[1]。在养殖大鲵的细菌性疾病中，气单胞菌属中的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)[3]等是常见的致病菌，能引起皮肤溃疡及败血症等。在养殖大鲵感染嗜水气单胞菌的研究中有分离鉴定的报道，但少见系统的病理组织学研究。将嗜水气单胞菌感染大鲵并进行组织病理学观察，可以促进嗜水气单胞菌对大鲵致病机理的研究和提供研究依据。

图3 BPA暴露7 d各组大鼠子宫组织结构变化(H.E.染色，100×)
Fig.3 Structural changes of uterine tissue of rats in each group after 7 days of BPA exposure(H.E.staining,100×)
A～D:剂量分别为0、20、60、180 mg/(kg·bw)
A～D: Uterus structure of 0、20、60、180 mg/(kg·bw) group separately

图4 BPA暴露7 d各组大鼠卵巢组织结构变化(H.E.染色，40×)
Fig.4 Structural changes of ovarian tissues in each group of rats after 7 days of BPA exposure(H.E.stain,40×)
A～D:剂量分别为0、20、60、180 mg/(kg·bw)
A～D: Uterus structure of 0、20、60、180 mg/(kg·bw) group separately

1 材料与方法

1.1 样本 病理样本：将由病死大鲵中分离得到的嗜水气单胞菌接种于正常大鲵。采取接种后死亡的大鲵脏器，取部分组织用于分离鉴定，其余的保存在10%中性福尔马林溶液中。(从采取的组织内鉴定出嗜水气单胞菌，证明大鲵被感染。)

正常样本：养殖大鲵的新鲜脏器(购自重庆某大鲵养殖场，用10%中性福尔马林固定)。

1.2 方法 制备再改良的Harris苏木素染液[4]及沉淀酸化伊红-Y染液[5]。将固定好的组织制作石蜡切片，并将完成H.E.染色的正常组织切片和病理组织切片在尼康E100显微镜下观察并摄影。

2 结果

正常大鲵组织的H.E.染色结果见中插彩版图1～12。嗜水气单胞菌感染大鲵的各组织的H.E.染色结果如下所述。

心：镜检心包膜脱落；部分心肌纤维肿胀、断裂；心肌细胞空泡变性，细胞核溶解、破裂；心脏内可见大量充血、淤血(见中插彩版图13)。

肝：镜检肝脏内存在大量坏死灶，坏死灶中的细胞破裂、溶解，在坏死灶周围可见大量的炎性细胞浸润；肝索排列紊乱，血窦间充满大量红细胞；肝细胞肿大，发生空泡变性、淀粉样变性(见中插彩版图14)；小叶间静脉及毛细血管内淤血(见中插彩版图15)；小叶间胆管细胞空泡变性、细胞核被挤于一侧，部分小叶间胆管破裂。

脾：镜检可见少量坏死灶，坏死灶内细胞溶解破裂；红髓、白髓大量减少；网状细胞胞核溶解、碎裂(见中插彩版图16)。

肺：镜检肺泡腔内充满数量不等的红细胞，部分囊腔内可见炎性细胞；肺动脉充血(见中插彩版图17)；平滑肌层内可见少量红染蛋白性物质；部分肌纤维空泡变性，有的细胞核溶解。

肾：镜检肾动脉充血；肾间质出血，有大量红细胞浸润；肾小管上皮细胞胞核溶解、破裂(见中插彩版图18)，管腔内可见脱落的上皮细胞、红细胞及均质红染的蛋白样物质；肾小球球囊囊间隙增宽；周围的结缔组织疏松水肿。

胰：镜检可见胰腺细胞溶解、破裂、坏死；部分区域有炎性细胞浸润；存在散在的出血点；血管内有蛋白纤维性物质(见中插彩版图19)。

肠：镜检小肠黏膜上皮细胞脱落，杯状细胞增加，纹状缘消失，肌层与浆膜层间隙增大(见中插彩版图20)；黏膜层出血；黏膜层可见炎性细胞浸润(见中插彩版图21)。

胃：镜检胃黏膜脱落；黏膜上层轻微出血；外纵肌层肌细胞肿胀断裂，颜色深染；肌肉层与浆膜层间隙增大(见中插彩版图22)；部分区域浆膜脱落。

皮肤：镜检表皮脱落，皮肤结构不完整(见中插彩版图23、图24)，腺泡腔内充满大量红细胞，毛细血管内可见淤血。

3 讨论

3.1 嗜水气单胞菌对大鲵脏器组织损伤机理 嗜水气单胞菌是气单胞菌属的模式种，革兰阴性，为短小杆菌，有鞭毛，无荚膜，不形成芽孢。生长温度为4～41 ℃，最适温度为25～30 ℃。生长pH值为5.0～9.0，最适pH值为7.2～7.4，可引起鱼类的肠炎，蛙的红腿病，也可造成大鲵的腹水病、腐皮病[2,7-9]。因嗜水气单胞菌能通过许多不同的调节机制改变基因表达和适应生存环境，现被认为是病原菌而非机会性致病菌[10]。病菌目前已知的毒力因子有：粘附素、脂多糖、胞外产物等，其中粘附素是细菌感染动物的关键[11]。

在自然条件下，嗜水气单胞菌可通过粘附素粘附于中国大鲵皮肤、肠道的细胞表面，通过一定的机制、途径侵入动物机体，定植于皮肤及肠道内的细胞[12-13]。在细菌定植期间，菌体的膜外蛋白与宿主细胞膜受体的糖残基发生反应，从而聚集在宿主细胞上；细菌的脂多糖可使菌体改变代谢，以适应温度、pH值、渗透压等，同时作为细菌内毒素的主要物质又可造成组织内白细胞数目变化和弥散性血管内凝血，抑制层粘连蛋白和嵌有脂质的层粘连蛋白受体的结合，使黏膜、浆膜受损；其膜外蛋白、S层蛋白、胞外蛋白酶等可保护菌体免受吞噬及抗体、补体的作用[7,10-14]。细菌定植后大量繁殖，夺取宿主的营养，使大鲵机体的抵抗力进一步下降，肠道中的菌体通过肝门静脉感染肝脏、胰脏等器官[6]，进而通过体循环感染全身各组织脏器。菌体在不同的组织细胞内定植、增殖后产生外毒素。大多数的外毒素又通过蛋白酶降解发挥活性，其中：溶血素具有溶血性与细胞毒性，能引发败血症与介导炎症反应，亦可抗吞噬；气溶素具有溶血性、肠毒性和细胞毒性，其成熟的蛋白可破坏细胞膜的渗透性使细胞死亡；尿素酶对菌体具有保护作用，还可产生氨削弱黏液的屏障功能，造成细胞变性[7,11-14]。在各种毒力因子的作用下，对大鲵机体造成损伤。

与自然条件不同，本试验的大鲵病理样本为腹腔注射接种嗜水气单胞菌的感染病例。细菌直接粘附于内脏组织，定植于各器官的细胞上，进行增殖，产生毒素。各种毒素因子相互协作共同作用于大鲵机体，损伤组织脏器的黏膜、浆膜，影响白细胞数量变化，使组织细胞发生变性，血管内充血、淤血。从病理切片的观察结果中亦可证实：胃、肠的黏膜受损；皮肤表皮脱落；肾小管上皮细胞脱落、碎裂；心脏、肝脏及肾脏的细胞发生变性，可见细胞溶解、碎裂，肝内存在大量的坏死灶；肝、肠、胰有炎性细胞浸润，脾脏白髓减少；多数组织器官内有不同程度的充血、出血及淤血。其中对肝脏、肾脏、脾脏造成的病理损伤最为严重，影响大鲵的物质能量代谢，破坏内环境稳态，降低大鲵的免疫能力，最终使多器官、系统功能衰竭，造成死亡。

3.2 嗜水气单胞菌感染与大鲵养殖的关系 我国大鲵人工繁育成功已有40年，在大鲵的病害方面的研究也有多年的经验累积。嗜水气单胞菌感染中国大鲵是细菌、环境及宿主间复杂的分子作用的结果[8]。在自然环境中生长的大鲵对疾病有较强的抵抗力，是因为：野生大鲵种群密度较小；食物多样；环境水质环境良好，溶解氧气充足；病源少且不易传播[15]。相比在人工养殖的环境中，虽然大鲵的食物来源得到保证，但是食物种类单一；随着集约化程度的不断提高，大鲵打斗致使皮肤破溃的机率增大；且在一定季节，养殖场内的水质环境与嗜水气单胞菌的最适生长温度、pH值相近，使得养殖大鲵更易染病。因此，保持大鲵养殖场环境良好，定期消毒检疫，合理控制大鲵养殖密度，实行分级饲养技术，可减少大鲵疾病的发生[16]。科学的饲养与综合管理对疫病的预防、发生及控制起着至关重要的作用。