伊维菌素氧化降解杂质的分离与鉴定

马志珺,王克华，任风芝 ,王 月，张 丽,李晓露*,张雪霞*

(1.微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 052165；2.华北制药集团爱诺有限公司，河北 石家庄 052165)

伊维菌素作为一种新型抗寄生虫药物，具有广谱、高效、低毒等特点，对线虫、节肢动物及其它体内外寄生虫的驱杀作用均良好，应用于猪、羊、马、牛的胃肠道线虫、肺线虫的治疗以及心丝虫、疥螨等的防治[1-4]。

伊维菌素(H2B1a，图1)为十六元环结构的大环内酯类抗生素，通过在阿维菌素B1a的C22、C23位上的双键加氢还原而成，比阿维菌素结构更稳定、安全性更高、持效期更长[5-6]，在国内外市场上具有很强的竞争力。

图1 伊维菌素的结构式

药物杂质是反映药物质量的重要指标，药物杂质能否被合理、有效地控制，将直接影响药物质量可控性及使用安全性。强制降解实验属于药物稳定性研究内容之一，有助于揭示药物的稳定性和可能降解途径，对药物的质量控制有重要意义。为了更好地控制伊维菌素质量，满足高端客户需求，作者将伊维菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中进行加速降解，得到伊维菌素氧化降解杂质粗品，利用色谱纯化技术对伊维菌素氧化降解杂质粗品进行分离纯化，并运用MS、NMR分析对其结构进行鉴定，为伊维菌素的质量控制和安全性评价提供保障。

1 实验

1.1 试剂与仪器

伊维菌素(纯度99.1%)，自制；乙腈、甲醇，色谱级，美国Merck公司；乙腈、甲醇，工业级，安徽时联特种溶剂股份有限公司；纯化水，自制；其它试剂均为国产分析纯。

分析型液相色谱仪，日本岛津公司；制备型液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司；T-1000型电子天平，常熟双杰测试仪器厂；Acquity UPLC系统、Xevo TQ MS/MS检测器，Waters公司；AVANCEⅢ-500型核磁共振波谱仪，Bruker公司；Loborata 4000型旋转蒸发器，Heidolph公司。

1.2 伊维菌素的加速降解

取伊维菌素原粉10 g，用500 mL 80%甲醇溶液溶解，加入10 mL H2O2，摇匀后，于25 ℃下进行氧化降解反应，定期检测反应液，当反应液中目标杂质达到一定比例时，将反应液减压浓缩、干燥，得到伊维菌素氧化降解杂质粗品。

1.3 伊维菌素氧化降解杂质的分离纯化

将伊维菌素氧化降解杂质粗品用甲醇溶解，经中压柱(UniSil C18,20 μm,200 mL)进行层析分离，洗脱剂为甲醇-水(70∶30，体积比，下同)，流速为10 mL·min-1，根据洗脱峰分段收集洗脱液，HPLC在线检测，检测波长280 nm，收集目标杂质纯度大于70%的洗脱液，减压浓缩至干，得到高比例的氧化降解杂质粗品。

将高比例的氧化降解杂质粗品用制备型液相色谱仪经中高压色谱纯化技术进一步纯化，按色谱峰收集目标馏分，将纯度大于95%的馏分合并，50 ℃下减压浓缩去除溶剂，得到2.1 g伊维菌素氧化降解杂质纯品。

1.4 检测条件

制备色谱条件：UniSil C18柱(30 mm × 250 mm，10 μm)，洗脱剂为乙腈-甲醇-水(50∶15∶35)，流速16 mL·min-1，检测波长280 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子检测，离子源温度为150 ℃，电离电压为3.0 kV，电喷雾接口干燥气(N2)流速为600 L·h-1，锥孔电压为30 V，脱溶剂气温度为350 ℃。

核磁共振条件：样品用CD3OD溶解。

2 结果与讨论

2.1 加速降解条件选择

在伊维菌素加速降解过程中发现，伊维菌素的氧化降解程度与H2O2加量、反应时间呈正相关，但过量的H2O2会使反应剧烈，生成多个降解产物，致使目标杂质分离纯化难度加大。综合考虑，选择H2O2加量为2%，HPLC检测目标杂质比例达到10%为反应终点。伊维菌素氧化降解杂质粗品和纯品的HPLC图谱见图2。

图2 伊维菌素氧化降解杂质粗品(a)和纯品(b)的HPLC图谱

2.2 伊维菌素氧化降解杂质的结构表征

2.2.1 质谱分析(图3)

图3 伊维菌素氧化降解杂质的质谱图

2.2.2 核磁共振波谱分析

伊维菌素氧化降解杂质的13CNMR、1HNMR数据见表1。

表1 伊维菌素氧化降解杂质的13CNMR、1HNMR数据

2.2.3 结构解析

由ESI+准分子离子峰图谱得到m/z906[M+NH4]+；由ESI-准分子离子峰图谱得到m/z887[M-H]-。推测伊维菌素氧化降解杂质的相对分子质量为888，比伊维菌素的相对分子质量多14。参照文献[7-8]对NMR数据进行分析，发现该杂质C8a位由亚甲基变成了羰基，推测其分子式为C48H72O15。

综上，确定该氧化降解杂质为8a-oxo-H2B1a，其结构式见图4。

图4 伊维菌素氧化降解杂质的结构式

3 结论

伊维菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中进行加速降解，得到伊维菌素氧化降解杂质粗品，利用色谱纯化技术对伊维菌素氧化降解杂质粗品进行分离纯化，并运用MS、NMR分析鉴定其结构，确定该氧化降解杂质为8a-oxo-H2B1a。该研究开发了一种制备伊维菌素氧化降解杂质的有效方法，揭示了杂质的来源、结构及控制方法，为伊维菌素的质量控制和安全性评价奠定了基础。