白凤菜总黄酮对急性髓系白血病Kasumi-1 细胞株增殖和凋亡的影响

刘慧丽，阙文忠，林燕燕*，林泽燕，徐文鑫，蔡阳艳

（1. 漳州卫生职业学院医学技术系转化医学检测应用技术协同创新中心，福建 漳州 363000；2. 福建医科大学附属南平第一医院风湿免疫科；3. 漳州卫生职业学院药学系）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类髓系造血干／祖细胞恶性疾病，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征。尽管治疗方法和新技术不断优化和发展，绝大多数患者预后仍不理想［1-2］。因此，迫切需要新的药物来辅助治疗、提高疗效。从植物中开发出低毒、高效甚至高度特异性的靶向药物一直是临床热点之一。植物总黄酮（TFG）具有抗氧化、抗肿瘤等多种活性，尤其在抗肿瘤的开发中具有潜在的价值。有文献报道其在乳腺癌、肺癌、食管癌等实体瘤细胞体外实验均有诱导凋亡的作用［3-6］，但对血液系统的肿瘤研究鲜见报道。本课题组从白凤菜（Gynura formosanaKitam.）中提取了TFG，旨在体外观察 TFG 对 AML Kasumi-1 细胞的增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Kasumi-1 细胞由福建医科大学天然药物药理学重点实验室惠赠；RPMI 1640培养液、磷酸盐缓冲液和胎牛血清购于美国Gibco公司；噻唑蓝（MTT）细胞凋亡试剂盒、Annexin V-FITC／PI 凋亡试剂盒、线粒体膜电位试剂盒、细胞周期试剂盒购自上海碧云天公司；荧光显微镜、多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific 公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；倒置显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 TFG 的制备 白凤菜由台湾引种，TFG 的制备参见文献［7］。根据亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法使样液显色，测定吸光度［8］，计算样液中的 TFG 含量为 2.76 mg／ml。

1.2.2 细胞培养 将Kasumi-1 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5%CO2、湿度饱和的恒温培养箱中培养，每 1 ～2 d 传代1 次，取对数生长期细胞为实验对象。

1.2.3 细胞抑制率检测 使用MTT 法检测细胞体外增殖。以5×103个／孔的密度将细胞接种于96 孔板 100 μl 的培养基中，设 4 个重复孔，利用高压灭菌的蒸馏水稀释TFG，使各组TFG 至终质量浓度分别为 0、6.25、12.5、25、50、100 μg／ml 并分别培养24、48 h。空白对照为无细胞培养基，有Kasumi-1 细胞而未添加TFG 的孔为阴性对照组（100 μl）。随后，在每个孔中加入 10 μl MTT 溶液（5 mg／μl 溶解于 PBS），将其放回细胞培养箱中继续孵育 4 h。每孔加入 100 μl Formazan 溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育 3 h，直至Formazan 全部溶解。随后酶标仪在570 nm 测定吸光度，重复3 次，计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率 ＝（A实验- A空白）／（A对照- A空白）×100%；抑制率＝1-细胞存活率。

1.2.4 细胞形态学观察 收集对数生长期细胞，以5×105个／孔接种于6 孔板，设置各实验组TFG终质量浓度为 0、6.25、12.5 和 25 μg／ml，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，随后在倒置显微镜下进行细胞形态学观察并拍照。

1.2.5 线粒体膜电位检测 将Kasumi-1 细胞用TFG 终质量浓度为 0、6.25、12.5 和 25 μg／ml 作用 24 h 后，1 000 r／mim 离心 5 min，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。取1×105重悬的细胞，1 000 r／mim 离心 5 min，弃上清，加入188 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。加入 2 μl Mito-Tracker Red CMXRos 染色液、5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育20～30 min，孵育过程中重悬细胞2～3 次，随后置于冰浴20 min，1 000 r／mim 离心 5 min，收集细胞，用100 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞，荧光显微镜下随机选择视野拍照。

1.2.6 细胞凋亡检测 取处于对数生长期的Kasumi-1细胞，以 5×104个／ml 接种 3 ml／孔于 6孔板，培养箱中孵育过夜。各组分别用0、6.25、12.5 和 25 μg／ml 的 TFG 作用于细胞 24 h 后各自收集培养体系内全部细胞，1 200 r／min 离心 5 min，弃上清，加入 195 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞，依次加入 5 μl Annexin V-FITC、10 μl 碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀。室温（20～25 ℃）避光孵育 10 ～20 min，随后置于冰浴中，随后充分混匀入流式细胞仪检测。

1.2.7 细胞周期检测 取处于对数生长期的Kasumi-1细胞，制备细胞悬液 5×104个／ml，接种3 ml／孔于 6 孔板，各组分别用 0、6.25、12.5 和25 μg／ml 的 TFG 作用于细胞，培养箱中孵育 24 h。随后收集各培养体系中全部细胞，1 000 r／min 离心5 min，弃上清，加入1 ml 预冷 PBS 重悬细胞，离心收集细胞，加入1 ml 冰浴预冷70%乙醇，吹打混匀，4 ℃ 固定 2 h，随后 1 000 r／min 离心 3 min，弃上清，预冷 PBS 洗涤 2 次，每管细胞样品中加入0.5 ml PI 染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴 30 min。充分混匀后，进样于流式细胞仪检测计算 G0／G1、S、G2／M 期所占百分比。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析、t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFG 对Kasumi-1 细胞体外增殖抑制的影响与对照组比较，TFG 作用 24 h 后 12.5 μg／ml 及以上浓度实验组，TFG 作用 48 h 后 6.25 μg／ml 及以上浓度实验组，Kasumi-1 细胞抑制率呈现出显著差异（P＜0.05），呈浓度依赖效应。分别以24和48 h 的抑制率对TFG 浓度绘制生长抑制曲线，可得 TFG 对 Kasumi-1 作用 24 h 和 48 h 的 IC50分别为 18.80 μg／ml 和 7.9 μg／ml。见图 1。

图1 TFG 对Kasumi-1 细胞体外的生长抑制率

2.2 TFG 对Kasumi-1 细胞形态的影响 Kasumi-1细胞易成团生长；随着 TFG 质量浓度的升高，Kasumi-1细胞团数量减少，形态皱缩，边缘粗糙，胞体缩小，胞体折光度减小，内含物减少。见图2。

2.3 细胞荧光凋亡检测 对照组中细胞核排列相对紧密，核染色质分布均匀，发出红色荧光，未见绿色凋亡荧光细胞；6.5 μg／ml TFG 实验组中细胞数量、排列及荧光与对照组比较无明显差异，可见散在绿色凋亡荧光细胞；与对照组比较，12.5 μg／ml TFG 实验组中细胞数量减少，较多细胞出现明亮绿色荧光细胞，表明部分细胞的细胞膜受损；25 μg／ml TFG 实验组中细胞数量下降明显，细胞胞体不均一，部分发生染色质凝集和细胞膜破损，出现较多明亮绿色荧光细胞。见图3。

图2 倒置显微镜下观察Kasumi-1 细胞经TFG 处理24 h 后细胞形态的变化（×100）

2.4 TFG 对Kasumi-1 细胞凋亡的检测 Kasumi-1细胞经 TFG 处理 24 h 后，0、6.25、12.5 和 25 μg／ml TFG 组细胞凋亡率分别为（2.2±0.2）%、（38.7±1.9）%、（50.6±3.7）%和（93.0±8.2）%；与对照组比较，随着TFG 质量浓度的升高，细胞凋亡比例逐渐增加（P＜0.05）。见图4。

2.5 TFG 对Kasumi-1 细胞周期分布的影响 TFG处理 24 h 后，6.25、12.5 μg／ml TFG 实验组与对照组S 期、G2／M 期细胞比例比较差异无统计学意义；但 25 μg／ml TFG 实验组的 S 期细胞比例高于对照组，G2／M 期细胞比例低于对照组（P＜0.05）。见图 5。

图3 荧光显微镜下观察Kasumi-1 细胞经TFG 处理24 h 后细胞形态的变化（×100）

图4 Kasumi-1 细胞经TFG 处理24 h 后细胞凋亡情况

3 讨论

自然来源的营养素能有效消除癌症细胞，探索天然、高效和低毒的药物进行长期的辅助抗癌具有重要意义。在本课题组前期研究中已经证实TFG 对肝癌HepG2 细胞亦有明显的诱导凋亡作用［7］，TFG 作用 24 h 及 48 h 的 IC50分别为 190.80 μg／ml 和 125.96 μg／ml。而本研究结果显示 TFG作用 Kasumi-1 细胞 24 h 及 48 h 的 IC50分别为18.80 μg／ml 和 7.9 μg／ml。在线粒体膜电位荧光凋亡检测中显示，随着TFG 的浓度升高，磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使PS 暴露于细胞外部，与带有绿色荧光的FITC 标记的Annexin V 染色，结果显示绿色荧光细胞随药物作用的浓度增加细胞凋亡明显。流式凋亡检测结果与线粒体膜电位检测结果一致。细胞周期检测表明TFG可影响Kasumi-1 细胞周期分布，使细胞周期阻滞于 S 期。

图5 Kasumi-1 细胞经TFG 处理24 h 后细胞周期的变化

综上所述，一定质量浓度的TFG 可抑制Kasumi-1 细胞活性并诱导其凋亡，待进一步研究作用机制及动物实验后，为研究和开发 TFG 作为抗AML 的天然药物提供理论基础。