髋关节发育不良患者血清和滑膜炎性因子的作用

邬波，王译晗，马旭，焦递进，王佳媛，吴铁伦

（1. 辽宁省骨关节病重点实验室，辽宁 沈阳 110044；2. 沈阳市骨科医院关节外科；3. 病理科）

髋关节发育不良（developmental dysplasia of the hip，DDH）是一种常见的发育障碍性疾病，具有长期慢性疼痛和髋关节活动受限等主要病理特征。这种疾病治疗的一般标准是早期发现和早期治疗，90%的病例可使病情恢复正常［1-2］。晚期DDH 需要手术治疗严重的发育不良和髋关节脱位［3-5］。然而即使晚期 DDH 手术成功后，文献报道，在45 年随访中仍有46%的患者需要全髋关节置换术治疗骨性关节炎［4］。因此，DDH 患者最终将会发展为退变性髋关节炎。本文对DDH 患者血清和滑膜中炎性因子进行分析研究，阐述DDH 的病变机制，探讨DDH 发展为髋关节炎与血清和滑膜中炎性因子的相关性，为DDH 的保守治疗提供理论指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2017 年9 月至2019 年9 月在我院行人工髋关节置换术患者50 例为研究对象，取血清、滑膜标本，其中 DDH 患者 25 例为观察组和股骨颈骨折患者25 例为对照组。DDH 患者包括男 8 髋，女 17 髋，年龄 44 ～ 68 岁，平均 55.3岁；股骨颈骨折患者包括男7 髋，女18 髋，年龄50～69 岁，平均 59.3 岁。2 组患者在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义，具有可比性。纳入标准：（1）Crowe 分型Ⅰ-Ⅱ型的髋臼发育不良患者；（2）髋臼疼痛，需行手术治疗者；（3）X线片髋关节没有严重的退行性改变，日常髋关节没有明显疼痛感觉。排除标准：（1）患有髋关节骨性关节炎的患者；（2）既往经历过髋部手术的患者。本研究经我院伦理委员会批准，患者自愿捐赠标本并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 HE 染色液（Baso，珠海贝索）；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒SP-9001（ZSGB-BIO，北京中杉金桥）；抗 IL-6 抗体、抗基质金属蛋白酶 3（matrix metalloproteinase3，MMP-3）抗体和抗金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）抗体（Bioss，北京博奥森）；Olympus 显微镜及CellSens standard 图像采集系统。

1.3 方法

1.3.1 组织学观察 关节置换后切取髋关节滑膜，共计50 个标本。将标本置于10%甲醛溶液中固定，12%中性EDTA-2Na 常温脱钙1.5 min，经梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后作厚度为4 μm的连续切片。切片行 HE 染色（具体操作详见说明书），观察2 组滑膜的病理改变情况。

1.3.2 免疫组化分析 采用免疫组化SP 法对2组石蜡切片进行IL-6、MMP-3 和TIMP-1 免疫组化染色分析。切片脱蜡至水，0.125%胰蛋白酶37℃下行抗原修复20 min，用体积分数为3%的H2O2室温阻断5 min，山羊血清封闭 15 min，在一抗IL-6（1∶350）、MMP-3（1∶200）或 TIMP-1（1∶400）中 4 ℃孵育过夜。冲洗后，分别与生物素标记的山羊抗小鼠IgG 反应1 h 以及链霉卵白素反应1 h，最后用含有DAB 的缓冲液显色，脱水透明，中性树胶封片。免疫组化切片置于 100 倍Olympus显微镜下观察，每个标本随机选取5 个不重叠视野，测定5 个积分光密度（ integral optical density，IOD）值取平均值，利用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行图像分析，半定量测定IL-6、MMP-3和 TIMP-1 的 IOD，比较 2 组 IL-6、MMP-3 和TIMP-1 的蛋白表达情况。

1.3.3 酶联免疫吸附试验 抽取患者静脉血2 ml，离心分离血清，将血清标本加入至包被有兔多克隆抗人 IL-6、MMP-3 或 TIMP-1 抗体的 96 孔微滴定量板中，37 ℃孵育l h。洗涤缓冲液洗3 次，加入酶标二抗（经滴定后的稀释度）0.1 ml，37 ℃孵育 l h。洗涤 3 次，加入临时配制的 TMB底物溶液 0.1 ml，37 ℃ 孵育 15 min。2 mol／L 硫酸终止反应。酶标仪450 nm 下检测吸收率。用标准重组人类 IL-6、MMP-3 或 TIMP-1 绘制标准曲线。每个血清标本检测3 次，取平均值记录实验数据。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察 HE 染色发现，对照组滑膜未见明显增生，被覆细胞排列较为规则，少量炎性细胞浸润，滑膜下层血管组织无明显病理改变。DDH 组滑膜呈乳头状增生，被覆细胞增生，表面纤维素渗出，大量炎性细胞浸润，滑膜下层新生血管形成，血管扩张，见图1。

2.2 免疫组化结果分析 IL-6 免疫组化染色于细胞核和细胞之中，MMP-3 和TIMP-1 免疫组化均染色于细胞质中；观察组滑膜中IL-6 及MMP-3的棕色物质表达较对照组显著增加，见图2。观察组滑膜中IL-6、MMP-3 的IOD 值显著高于对照组（P＜0.05）；2 组 TIMP-1 的表达差异无统计学意义，见表 1。

2.3 酶联免疫吸附试验结果 观察组血清中的IL-6及MMP-3 均较对照组显著增加（P＜0.05），2 组血清TIMP-1 比较差异无统计学意义，见表2。

3 讨论

DDH 即髋关节发育异常，通常会导致一系列的有害影响，从中度髋臼发育不良到股骨头半脱位或脱位［6］。中国每年有1%～5%的新生儿受到DDH 影响，不同人群中女性与男性比例在4∶1 ～10∶1 之间［7］。其主要解剖学特征包括髋关节变浅，松弛关节囊，关节间隙缩小和髋关节紊乱，导致慢性疼痛，髋关节周围炎症，滑膜增生和髋臼肥大［8］。DDH 初期以保守治疗为主，通常需口服氨糖类药物及减轻负重，缓解关节疼痛。对于晚期诊断的DDH，一般治疗无法使髋关节恢复正常，会导致髋关节的持续退变，表现为关节软骨的退行性病变及髋关节炎，给医疗保健系统带来长期的负担［9］。当 DDH 患者关节磨损严重，疼痛影响日常工作生活时，需行关节置换手术治疗。

图1 观察组和对照组患者髋关节滑膜HE 染色结果（×200）

图2 观察组及对照组免疫组化染色结果（×200）

表 1 2 组患者 IL-6、MMP-3 和 TIMP-1 免疫组化染色的IOD 值比较

表2 2 组患者血清中 IL-6、MMP-3 及 TIMP-1的表达水平比较

DDH 病变机制复杂，细胞外基质降解是DDH重 要 的 病 理 改 变 之 一［10］。基 质 金 属 蛋 白 酶（MMPs）是细胞外锌依赖性内肽酶的大家族，其在生理和病理条件下催化细胞外基质的产生和降解，TIMPs 作为MMPs 的抑制剂起到平衡MMPs 的作用［11-12］。本研究结果显示，观察组中 MMP-3的表达较对照组显著增加，高出正常值的1 倍，2组中TIMP-1 的表达未见明显差异。同时，MMP-3在观察组与对照组之间差异较TIMP-1 在2 组间的差异大，因此推断MMP-3 的作用超过了TIMP-1的作用，二者间的平衡被破坏而加剧了关节软骨的降解，提示在临床诊断时患者血清中MMP-3 含量超出正常值1 倍时，有发展为骨性关节炎的风险，可提示DDH 患者在软骨代谢层面上存在严重的关节退变，需药物或减轻负重等保守治疗方法进行干预。本研究结果为研究DDH 患者关节软骨代谢调节及病程向骨性关节炎发展等方面提供了一种新的视野。

DDH 被认为是骨性关节炎的主要因素之一，但与传统骨性关节炎的病程进展有所不同，本研究结果显示，观察组滑膜呈乳头状增生，被覆细胞增生，表面纤维素渗出，大量炎性细胞浸润，滑膜下层新生血管形成，血管扩张，提示DDH 患者的滑膜具有滑膜炎症，有进一步发展为骨性关节炎的可能。而IL-6 是T 淋巴细胞分泌的一种炎性促进细胞因子，异常升高促进成纤维细胞和基质小分子的降解，破坏软骨的结构和功能［13］。本研究中观察组滑膜和血清中的IL-6 的表达较对照组有明显增加，DDH 组血清中IL-6 的含量高出对照组2 倍以上，本研究结果提示DDH 患者向骨性关节炎发展的过程与IL-6 具有一定的相关性，说明IL-6 在DDH 的发病发展中起着重要作用，与MMP-3 及TIMP-1 共同作用导致DDH 的病程进展，为辅助指导临床进行保守治疗干预的提供数据依据。

综上所述，DDH 患者关节软骨内软骨退变指标MMP-3、TIMP-1 及炎性指标IL-6 可以辅助诊断DDH 的病程进展，作为DDH 患者的临床诊断炎性指标。本课题组将对DDH 的病理改变及发展机制进行进一步研究，为DDH 患者病程的临床诊断提供理论支持，提示患者加强防护，缩短患者入院诊断时间，缩减诊断流程，以提高保髋手术的疗效。