肾透明细胞癌中长链非编码RNA 的鉴定及验证

马慧敏，冯钢

（1. 皖南医学院研究生院，安徽 芜湖 241002；2. 皖南医学院弋矶山医院检验科）

大量基因组测序和转录组分析的研究表明，人类转录组不仅包括蛋白编码RNA，还包括大量的非编码 RNA［1］。非编码 RNA 根据其长度分为长、短两种。microRNA（miRNA）是目前研究最多的短非编码RNA，在多种癌症中表达不同，其种子序列与 mRNA 的 miRNA 应答元件（miRNA response element，MRE）之间的碱基配对可抑制mRNA 翻译并介导 mRNA 衰减［2］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）被广泛定义为长度超过200 个核苷酸的非编码 RNA［3］。越来越多的研究报道，lncRNA 可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），与miRNA 的MRE 结合，保护目标mRNA 转录物不被降解。根据 ceRNA 理论，一些 lncRNA-miRNA-mRNA 网络已经在一些人类肿瘤中被发现，包括卵巢癌、肺腺癌和头颈鳞癌［4-6］。lncRNA-miRNA-mRNA 网络的发现为我们进一步了解肿瘤的增殖和转移提供了重要线索［7-9］。

肾癌是泌尿系统肿瘤中发病率最高的肿瘤之一。肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是肾癌中最常见的亚型，是一种恶性侵袭性肾癌，预后不良［10］。过去，人们一直致力于研究KIRC 生物标志物，以提高KIRC 患者的早期诊断和预后，但近年来研究的重点转变为蛋白编码基因或 miRNA［11-13］。有研究报道 lncRNA 在KIRC 中异常表达［14-15］，但 lncRNA 在 KIRC 中的临床意义和生物学作用尚未得到充分研究。

癌症基因组图谱（TCGA）数据库为分析不同基因组改变的高通量数据提供了便利，包括非编码RNA。本研究从TCGA 数据库中获取了KIRC 患者的 lncRNA、miRNA 和 mRNA 的表达谱，利用edgeR 工具包检测 KIRC 中差异表达的 lncRNA、miRNA 和mRNA，通过权重基因共表达网络分析（WGCNA）选择与临床信息相关的lncRNA 模块。为了阐明lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络中的交互作用，我们利用生物信息学分析预测了lncRNA-miRNA之间的相互作用，以及 miRNA-mRNA 之间的相互作用，同时利用TCGA KIRC 数据集和 KIRC 的临床样本，验证了 lncRNA 在ceRNA网络中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 TCGA KIRC 数据集 从TCGA 下载了mRNA表达芯片（72 个正常组织，539 个肿瘤组织）和miRNA 表达芯片（71 个正常组织，545 个肿瘤组织），网址为 https://portal.gdc.cancer.gov／，同时下载并提取 KIRC 患者相应的临床信息。lncRNA表达谱的鉴定根据GENCODE 的注释确定，网址为 http://www.gencodegenes.org。由于 TCGA数据（TCGA_KIRC_exp_HiSeqV2-2015-02-24）是公开的，我们的研究完全符合TCGA 提供的发布指南，因此不需要获得当地伦理委员会的额外批准。

1.2 KIRC 中 差 异 表 达 的 mRNA、miRNA 和lncRNA的鉴定 使用 edgeR 工具包检测 TCGA KIRC 数据集中差异表达的 mRNA、miRNA 和lncRNA［16］，阈值设置为 log2（肿瘤组织／正常组织）≥2，伪发现率＜ 0.01。

1.3 权重基因共表达网络构建 使用WGCNA R包把所有差异表达的lncRNA 纳入权重基因共表达网络分析［17］，根据无尺度网络分布，软件自动筛选的软阈值选择与KIRC 患者临床信息最相关的lncRNA 模块进行进一步探讨。

1.4 验证lncRNA 的临床作用 通过受试者工作特征（ROC）曲线评估所选模块中所有lncRNA 的诊断效能，通过 Spearman 相关分析探讨 lncRNA表达与临床病理因素的关系，采用Kaplan-Meier法检测这些lncRNA 的预后作用，并进行log-rank检验。我们还对这些lncRNA 进行了单因素和多因素Cox 回归分析。双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。统计分析均采用 SPSS 13.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）软件进行。

1.5 ceRNA 网络构建 MiRcode 测定lncRNA-miRNA的相互作用，网址为 http://www.mircode.org／［18］，从 miRTarBase、TargetScan、miRDB 中 检 索 到miRNA的靶向 mRNA，网址分别为http://mirtarbase.mbc. nctu. edu. tw ／、http://www. targetscan. org／vert_71／、http://www.mirdb.org／。利用 Cytoscape v3.6.1 构建 ceRNA 网络并进行可视化［19］。

1.6 基于KIRC 的临床样本验证ceRNA 网络中的lncRNA 为了进一步验证TCGA 数据库中lncRNA的作用，利用RT-qPCR 检测了临床样本中lncRNA的表达，收集 33 例 2018 年 1 月至 2018 年 7 月在皖南医学院弋矶山医院行无辅助治疗的肾切除术（根治性或部分性）患者的癌组织和癌旁组织标本。本研究经皖南医学院伦理委员会审核通过，并获得所有参与者的知情同意。相对表达式计算使用 2ΔCT方法［ΔCT ＝ CT（β-actin）-CT（目标基因）］。引物序列见表 1。配对t检验比较癌组织和癌旁组织lncRNA 的表达。

2 结果

2.1 KIRC 中差异表达的 lncRNA、miRNA 和mRNA 通过对lncRNA 表达谱的分析，共发现了1 821 个差异表达的lncRNA，其中包括1 211 个上调表达的 lncRNA 和 610 个下调表达的 lncRNA（图1）。此外，我们还发现了27 个上调表达和29个下调表达的 miRNA，以及1 587 个上调表达和799 个下调表达的mRNA。

表1 引物序列

图1 癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNAs

2.2 权重基因共表达网络的构建和关键模块的识别 为了得到差异表达的lncRNA 的功能簇，我们使用WGCNA 进行了基因共表达网络分析，权重参数 β ＝3（scale-free R2＝ 0.95），最小模块大小设定为30。共检测到7 个模块（图2A），分别为蓝色、棕色、绿色、灰色、红色、蓝绿色和黄色，这些模块中 lncRNA 的数量分别为 109、90、57、154、41、361 和 89。如图 2B 所示，蓝色模块与病理分期（cor＝ 0.314，P＜0.01）、转移（cor＝0.224，P＜0.01）、分级（cor＝ 0.396，P＜0.01）相关性最好。

图2 权重基因共表达网络的构建和关键模块的识别

2.3 蓝色模块中lncRNA 的临床价值 如表2 所示，蓝色模块中有15 个lncRNA 的ROC 曲线下面积在0.9 以上，提示这些lncRNA 可能在KIRC 的发生中发挥了重要作用，并对KIRC 患者具有较高的诊断价值，lncRNA 和临床病理之间的关系见表3。AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC019069.1、AC114803.1、AC156455.1、AL161937.2、LINC00475、LINC01358、LINC01615、LUCAT1 和NPSR1-AS1 可以预测KIRC 患者病理分期为晚期分 期。AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC019069.1、AC114803.1、AC156455.1、AL161937.2、AL355102.4、LINC00475、LINC01358、LINC01615 和 LUCAT1 可以辨别高病理分级的KIRC 患者。单因素 Cox 分析显示，AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC156455.1、AL161937.2、AL355102.4、LINC00475、LINC01615、LUCAT1、NPSR1-AS1 与 KIRC 患者的总体生存期相关，多因素 Cox 分析显示，AL161937.2 和 LUCAT1 可能是 KIRC 的独立预后指标（P＝ 0.032，P＝0.019），见表 4。如图 3A、3B 所示，Kaplan-Meier 分析显示，高表达 AL161937.2 和 LUCAT1的KIRC 患者的总体生存期明显低于低表达AL161937.2 和 LUCAT1 的 KIRC 患者（P均 ＜0.01）。

表2 具有KIRC 重要诊断价值的lncRNA 分析结果

表3 lncRNA 的表达与KIRC 的临床病理因素的关系

2.4 ceRNA 网络构建 通过MiRcode 一共预测到5 个靶向 AL161937.2 的 miRNA 和 39 个靶向 LUCAT1 的 miRNA。之后，我们根据 ceRNA 机制选择了 6 个下调表达的 miRNA。通过 TargetScan、miRDB、miRTarBase 等工具进一步预测这 6 种miRNA 的39 个上调表达的靶基因。最后，我们使用 2 个 lncRNA、6 个 miRNA 和 39 个 mRNA 构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络，见图 4。

2.5 临床样本验证ceRNA 网络中lncRNA 的临床意义 在 33 例配对的 KIRC 组织样本中，AL161937.2 在癌组织中的平均表达水平（0.012±0.009）明显高于其癌旁组织（0.004±0.002）（P＜0.01，图 5A），AUC 为 0.898（P＜ 0.01，图5B）。LUCAT1 在癌组织中的平均表达水平（0.021±0.015）明显高于其癌旁组织（0.006±0.004）（P＜0.01，图 5D），AUC 为 0.924（P＜0.01，图 5E）。如图 5C 和 5F 所示，AL161937.2和LUCAT1 的高表达与KIRC 的晚期病理分期和病理高分级相关。

表4 单因素和多因素分析预测KIRC 患者的总体生存期

图 4 lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络

图5 临床样本验证ceRNA 网络中lncRNA 的临床意义

3 讨论

已有报道称lncRNA 在肾癌中异常表达，提示其可能作为癌基因或肿瘤抑制因子［20-21］。此外，也有研究表明，lncRNA 可能适用于KIRC 的诊断，甚至用于预测预后［22-23］。虽然在 KIRC 中有学者研究了单个lncRNA，但基于高通量RNA-seq 数据的研究鲜有报道。本研究利用TCGA 数据库中的基因表达芯片对KIRC 的差异表达mRNA、miRNA和lncRNA 进行了鉴定，所有差异表达的lncRNA被用来构建权重共表达网络，通过WGCNA 本研究共鉴定出7 个模块。其中蓝色模块与肿瘤分期和分级的相关性最好，蓝色模块中的 109 个lncRNA，15 个 lncRNA 对 KIRC 的诊断价值极高，其AUC 均大于0.90。这些lncRNA 的表达与临床病理因素之间的关系也通过Spearman 相关检验得到了验证，进一步支持了WGCNA 的结果。此外，生存分析表明，AL161937.2 和 LUCAT1 是 KIRC 患者的独立预后因子，提示其预后价值。

到目前为止，只有少数研究报道了lncRNA 与mRNA，或 lncRNA 与 miRNA 在 KIRC 中的相互作用，关于KIRC 中ceRNA 交互作用的研究报道更少。根据ceRNA 假说，本研究通过生物信息学分析预测了lncRNA-miRNA 相互作用和miRNA-mRNA相互作用，并且构建了一个包含 2 个 lncRNA（AL161937.2 和 LUCAT1）、6 个 miRNA 和 39 个mRNA 的 ceRNA 网络。

LncRNA AL161937.2（也称 LOC101927512），位于染色体20q13.13。虽然目前还没有文献报道，但本研究发现 AL161937.2 在临床 KIRC 组织和TCGA KIRC 组织中均较正常组织有明显上调。此外，AL161937.2 在本研究中被确定为KIRC 新的诊断和预后标志物。基于对 MiRcode 的预测，AL161937.2 有 3 个 MREs，可以与 5 个 miRNA 结合。在这些 miRNA 中，只有 hsa-miR-138-5p 在KIRC 组织中显著下调［24］。有研究报道，hsa-miR-138-5p 的靶基因 VIM、TERT 和 ZEB2 在 KIRC组织中明显上调［25-27］，并且 VIM、TERT、ZEB2和hsa-miR-138-5p 之间的相互作用分别被Yamasaki等［28］、Zhang 等［29］和 Ding 等［30］证实。因此，本研究推测当 AL161937.2 高表达时，hsa-miR-138-5p会被抑制，导致在KIRC 中VIM、TERT 和ZEB2 的表达增加。

位于 5q14.3 号染色体的 LncRNA LUCAT1（肺癌相关转录1）在非小细胞肺癌中首次被发现［31］。最近，已有报道称 LUCAT1 在某些肿瘤中发挥作用［32-33］。本研究发现 LUCAT1 在临床 KIRC组织和TCGA KIRC 组织中均有上调，并与肿瘤进展相关，这与 Zheng 等［34］的报道一致。本研究通过MiRcode 预测了 39 个靶向 LUCAT1 的 miRNA，其中 hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-506-5p、hsamiR-429、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-141-5p 在TCGA KIRC 数据集中均有明显的低表达［35-37］。已有研究报道，这些miRNA 的靶基因包括VEGFA、TIMP1 和 CXCL10 在 KIRC 中显著上调［38-40］。此外，hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-200c-5p 与 VEGFA 的相互作用、hsa-miR-363-5p 与 TIMP1 的相互作用、hsamiR-200c-5p 与ZEB2 的相互作用已分别得到了前人研究的验证［41-43］。这些结果表明，LUCAT1 可能与 hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-506-5p、hsamiR-429、hsa-miR-363-5p 和 hsa-miR-141-5p产生竞争，从而调控 KIRC 中 VEGFA、TIMP1 和CXCL10 的表达。

在本研究中，我们利用TCGA KIRC 数据集中的大规模样本，筛选到 2 个潜在的 KIRC 的 lncRNA 生物标志物，并通过 RT-qPCR 验证了2 种lncRNA 在 KIRC 中的表达。更重要的是，我们构建了 lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络，这为更好地理解KIRC 中的ceRNA 调控提供了新的视角。然而，我们的研究也有一些局限性。首先，我们在33 个临床样本中只验证了2 个lncRNA 的表达，我们的研究结果是否可以推广到一般人群还有待确定。其次，我们的研究并没有验证所有lncRNA与miRNA 之间的相互作用，lncRNA（AL161937.2和LUCAT1）在KIRC 中的功能作用还需要通过实验进一步验证。