HPV E6／E7、E5 及 E2 蛋白与宫颈癌的关系研究进展

孟斐

（沈阳医学院附属中心医院妇产科，辽宁 沈阳 110024）

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，据估计，2018 年全球约有57 万新发病例和31.1万死亡病例，占女性癌症发病率的 6.6%，死亡病例的 7.5%，发病率及死亡率均居第四位，位于乳腺癌、肺癌及结肠癌后［1］。近年来随着筛查手段以及人们筛查意识的提高，宫颈癌的发生率和死亡率呈现下降趋势，但是宫颈癌易复发、高转移、预后差、放化疗不敏感等特点仍然严重威胁女性的生存质量［2］。人乳头瘤病毒（HPV）被认为是导致宫颈癌发生发展的原因之一。HPV 属于乳头多瘤空泡病毒科，乳头瘤病毒属，可分为早期区、晚期区和上游区，其中早期区编码的E1-E7 蛋白与病毒的复制及转录功能关系密切。HPV 对上皮细胞和黏膜有高亲噬性，可以通过微小创口感染鳞状上皮的基底层细胞，并随着基底层上皮细胞向表层细胞分化而完成DNA 的复制。在分化的表层上皮中，HPV 开始合成高拷贝数量的DNA，并合成衣壳，组装并释放病毒，造成感染。持续性HPV 感染会引起病毒DNA 整合进入宿主细胞基因组中，大多数早期及晚期基因会被破坏而失活，但编码E6、E7 的基因会被保留，同时其中E2 基因作为一种具有调控功能的基因，它的失活也会导致E6／E7 基因在宿主细胞内过量表达，参与宫颈癌的发生。但HPV 的致癌机制仍未被完全阐明，本研究欲对HPV E6／E7、E5 及E2 蛋白与宫颈癌关系进行综述。

1 HPV E6／E7 与宫颈癌

1.1 HPV E6／E7 HPV E6 基因定位于细胞核内，编码约150 个氨基酸，位于E7 开放读码框的上游，E6 蛋白发挥功能作用主要依靠锌指结构，通过结合锌离子使细胞永生化，同时影响转录及细胞蛋白结合。HPV E7 癌蛋白含有98 个氨基酸，没有已知的酶活性或DNA 结合域，C 末端锌指状结构域也与其他病毒癌蛋白相似，被命名为CR3。这些结构上的相似性反映在病毒癌蛋白之间的转化和反式激活的功能上的相似性。HPV E7 癌蛋白对病毒的正常生命周期和从良性前体病变到浸润性癌的整个癌症发展过程都是必不可少的。

1.2 HPV E6／E7 致癌机制 高危HPV 编码的E6和E7 被认为是影响宫颈细胞多步转化过程的主要因素，能够分别抑制p53 和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），并与调节细胞周期、基因组稳定性和表观遗传修饰的大量细胞信号因子相互作用［3-4］。也有研究指出E6／E7 病毒蛋白通过抑制细胞周期依赖性激酶（CDK）抑制剂（p21、p27、p16）和降解p53 和 pRb 破坏细胞周期检查点控制［5］。

高危型HPV E6 蛋白C 末端是一段高度保守的PDZ 结合域，由4 个氨基酸残基构成，介导其与宿主细胞的 PDZ 蛋白间的相互作用［6-7］，同时也有研究表明E6 蛋白也可以激活原癌基因C-myc，抑制端粒酶逆转录酶的转录抑制物，激活端粒酶逆转录酶，促进宫颈癌的发生［8］。也有研究指出HPV E6 蛋白可以通过上调氯离子通道蛋白5（CLCN5）的表达促进宫颈癌细胞的迁移［9］。干扰素是重要的抗病毒药物，可以调节病毒感染的初始和持续阶段。同时，HPV 可以从多方面调节宿主细胞对干扰素的应答。首先，HPV E6 蛋白可以通过下调多种干扰素应答基因表达水平，抑制干扰素的应答；其次，高危型HPV E6 可以通过抑制干扰素应答因子3（IRF3）对干扰素应答基因的激活能力抑制干扰素的应答［10］；此外，HPV E6可以通过与p53 和p300／CBP 相互作用，影响干扰素应答能力，促使人角质细胞生长停滞，使HPV感染的细胞癌变［11］。

E7 主要起转录调节作用。E7 基因调控的最佳机制是通过 pRb／E2F 系统。pRb 家族蛋白，也被称为“袖珍蛋白”，其部分功能是通过与E2F 转录因子结合并向启动子招募转录抑制复合物［12］。E7与pRb 家族成员结合并靶向降解，从而破坏抑制性复合物，促进DNA 合成机制在其他有丝分裂后分化的角质形成细胞中的表达。E7 降解pRb 将导致细胞周期的非计划进入S 期，最终促进细胞增殖［13］。HPV 病毒复制要求细胞进入 S 期细胞周期。这是通过灭活pRb 并释放E2F 家族转录因子来实现的，这些转录因子允许细胞周期从G1 检查点进行，一旦越过G1 检查点，细胞可以不受影响，进入 S 期，完成细胞增殖。E2F 家族可介导细胞增殖和p53 依赖或独立凋亡。E2F 的过度表达导致细胞周期蛋白D1、依赖性激酶活性的抑制和细胞周期相关基因CDKN2A、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2A（p16）基因产物的过度表达［13］ 。

一般来说，感染后宿主细胞激活先天性和适应性免疫系统，这些系统由主要的组织相容性复合体（MHC）Ⅰ和Ⅱ类控制。MHC Ⅰ类分子向CD8＋受体的细胞毒性T 细胞提供抗原，MHCⅡ类分子向CD4＋受体的辅助T 细胞提供抗原。在HPV感染过程中，病毒进入上皮细胞，这是抵抗感染的最外层物理屏障，并激活宿主的固有免疫系统。巨噬细胞、朗格汉斯细胞和自然杀伤细胞试图通过表达 Toll 样受体（TLRs）来抑制 HPV。TLRs 识别病毒成分并激活转录因子，如核因子κB（NF-κB）和 IRF3，产生细胞因子［14］。同时也有研究证明E7 可以通过诱导TLR9 启动子形成抑制复合物来抑制 TLR9 的表达［15］。这个复合物含有 NF-κB，但不是被激活，而是含有组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和组蛋白去甲基化酶来抑制TLR9 的表达［15］。但是选择性激活是如何实现的还不清楚。角质细胞感染高风险的HPV 基因型与癌症的发生有关。来自 HPV16、18、62 和 84，特别是高风险HPV16 和HPV18 E6 上调了角质细胞中IL-6 的表达，这可能有助于促进炎症和高度增殖的微环境，并且可以长期保留，最终导致宫颈癌的发生［16］。

2.1 HPV E5 HPV E5 蛋白是一种细胞膜结合蛋白，位于内质网高尔基复合体及细胞膜上，分子量较小，主要通过上调细胞生长因子受体发挥生物学功能，在病毒感染上皮组织之后，E5 常与E6、E7 蛋白共同作用，影响病毒的增殖和宿主细胞的永生化，参与宿主细胞的癌变。

2.2 HPV E5 的致癌机制 既往认为，在病毒与宿主细胞整合时，E5 常常因缺失不参与促进癌症发生发展。但最新研究认为，肿瘤病例中HPV16病毒基因组并不只是单纯完全整合到宿主细胞基因组中（E2／E7 ＝0），还同时存在游离型（E2／E7＝1）以及介于之间的混合型，且病毒整合多发生在肿瘤早期［20-21］，因此我们可以认为E5 在晚期肿瘤细胞中仍然有表达的可能。病毒可以阻碍宿主细胞自噬及利用这一过程进行增殖，在HPV16 感染早期，E5 蛋白强烈抑制角质形成细胞的自噬，而角质形成细胞生长因子受体（KGFR）的高表达则促进这一过程，故E5 蛋白和KGFR 之间的相互影响可能是HPV 扰乱上皮细胞稳态的重要机制［22］。HPV16 E5 抑制 ATPase 质子泵的作用，使细胞内碱化，突触小泡融合受到抑制，改变了表皮生长因子（EGF）的内吞途径，阻碍EGF 受体（EGFR）的降解，使 EGFR 增多［23］。Met 是一种对肿瘤细胞侵袭、运动和转移至关重要的生长因子受体。HPV E5 蛋白还具有促进c-MET 表达的能力，这在肿瘤细胞侵袭和转移中起着重要作用［24-25］。

1.3 观察指标及评价标准 观察两组患者伤口从清创缝合术后到拆线期间痂皮损伤及伤口愈合情况。①痂皮损伤判断:以伤口因肉芽组织或痂皮撕脱而出血或渗血为标准。②伤口愈合评价标准［1］:Ⅰ期愈合:伤口边缘对合良好或伤口缺损不大，局部无感染、血肿或坏死组织，再生和修复过程迅速，伤口修复以纤维组织为主，伤口愈合快，功能良好;Ⅱ期愈合:伤口有较多的缺损或空隙，边缘不整，伤口有红肿及炎症反应，修复以纤维组织为主，大量肉芽组织填充创腔，最后上皮组织覆盖，愈合时间长，瘢痕明显，功能欠佳;Ⅲ期愈合:感染伤口敞开和引流后，待感染控制和肉芽组织健康时再进行缝合。

2.3 HPV E5 与 miRNAs 研究发现，在 HPV16 E5 阳性的宫颈癌细胞系，miR-196a 表达量明显减少，提示HPV16 E5 蛋白能特异性下调miR-196a的表达［28］。同时，HPV16 E5 蛋白还能特异性上调HoxB8 的表达，而该基因是miR-196a 的作用靶点之一，两者表达量的变化对正常细胞转化为宫颈癌有协同促进作用［28］。E5 蛋白可以通过影响miRNAs-mRNA 靶向轴，影响宫颈癌的发生发展。但具体调节方式仍需要进一步实验支持。

HPV16 E5 蛋白与 E6、E7 相互作用也可以促进癌症的发展。Maufort 等［26］用雌激素处理 E5 转基因小鼠和非E5 转基因小鼠，结果前者出现的异常宫颈上皮细胞更多，此外，与仅表达一种病毒癌基因的小鼠相比，E5 与E6 或E7 联合可以诱发更严重的肿瘤疾病。Hu 等［27］研究发现，HPV16 E5 与E6、E7 共作用能增加双核细胞的形成率，而双核细胞形成将导致染色体不稳定性增加；同时还能使形成的双核细胞大量繁殖。由此我们可以认为，E5 在肿瘤发生的早期及晚期均有作用，且与HPV E6、E7 共同促进癌症发生发展的作用。

2 HPV E5 与宫颈癌

(3)不同油藏的原油组分含量不同，其CO2驱最小混相压力也存在差别，实际油藏的MMP与C2～C6组分具有负相关关系。

1.3 HPV E6／E7 与 miRNAs miRNAs 参与多种基本的细胞过程，包括癌变。异常表达的miRNAs 作为新型生物标志物在宫颈癌诊断中的应用潜力越来越大。张蔚等［17］实验证明与阴性对照组比较，在转染HPV16 E6 siRNA 的 SiHa 细胞中 miR-21、miR-9、miR-31 相对表达量明显下调，miR-497、miR-218 相对表达量明显上调，证明了异常miRNAs 表达与 HPV E6 基因相关；同时转染 HPV16 E7 siRNA 的 SiHa 细胞中 miR-21、miR-9、miR-31

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相对表达量明显下调，miR-497、miR-218 相对表达量明显上调，宫颈癌组织中异常表达的miRNAs与HPV16 E6／E7 基因有关。另一项研究显示miR-409-3p 直接参与了E6 癌基因水平的调控，从而证实了该miRNA 在宫颈恶性肿瘤中的潜在抑癌功能［18］。另一项实验也证明 5azadC 治疗上调 miR-375 水平，抑制 HPV16 E6 表达，其 miR-375 抑制剂的使用明确了 miR-375 参与 E6 抑制［19］。但HPV E6 与miRNAs 相互作用机制尚不明确，尚需要进一步研究以明确E6 与转录因子和信号蛋白的相互作用。

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3 HPV E2 与宫颈癌

3.1 HPV E2 HPV E2 蛋白是病毒生命周期中的关键蛋白，在转录调控、DNA 复制启动和病毒基因组分割等方面具有重要的功能［29］。它具有由富含丝氨酸、精氨酸的铰链区连接的DNA 结合域和反式激活域。E2 通常是病毒长控制区（LCR）中与同源序列（E2 结合位点［E2BSs］）结合的同型二聚体，有证据表明E2 参与控制病毒早期启动子，另一方面，E2 最重要的作用可能是作为辅助复制因子［29］。在 DNA 复制的起点，E2 与 HPV E1复制解旋酶相互作用，促进细胞 DNA 复制［29］。E2 在被感染细胞分裂过程中，通过与染色质适配器蛋白的相互作用，将病毒游离基因组与宿主有丝分裂染色体系在一起，在病毒游离基因组的分割过程中发挥重要作用。

3.2 HPV E2 的致癌机制 在癌变过程中，HPV16 DNA 整合到宿主细胞基因组中，导致调节基因E2 的表达缺失，而E2 在乳头瘤病毒中相对保守［30］。E2 蛋白除了作为转录调节因子外，还对良性病变中的 HPV E6 和 E7 负性调节［31］。高危型HPV 中的E2 蛋白已被证实能影响细胞的增殖、凋亡、病毒生命周期的调节和基因表达等过程［32-33］。以往的研究表明HPV E2 上调人C1q（gC1qR）基因表达，导致线粒体功能障碍而诱导宫颈癌细胞凋亡［34-35］，但实验发现 E2 介导的 E6／E7 抑制可能支持肿瘤细胞的局部扩散和侵袭性［36］。同时E2还参与细胞凋亡调控、细胞周期、角质形成细胞迁移和分化以及细胞内转运的蛋白质相互作用。有证据表明 E2 可以与其他病毒蛋白结合，如E4［37］、E6［38］、E7［39］、L1［40］和 L2［41］。特别是 E2结合L1 和L2 可能影响病毒衣壳的形成和病毒的释放。

4 展望

尽管宫颈癌的发病率及死亡率在减少，但它折磨女性的生理及心理。宫颈癌的发生发展经历数年至数十年，即便有些女性感染HPV 并不致癌，但是频繁的用药和往返医院检查以及病毒感染这一事实都使女性心理承受巨大压力。虽然宫颈癌的发病原因纷繁复杂，但是其与HPV 的感染有明确的相关性，对于HPV 各组分的确切研究是攻克宫颈癌的前提条件。目前对于HPV 各个成分研究已经初见成效，比如，HPV 的 L1 及 L2 蛋白只表达抗原而不含有可复制的病毒，所以通过重组DNA 技术表达 L1 或 L1 和 L2 蛋白，形成病毒样颗粒，不含有病毒核酸，其空间构象及抗原性与天然HPV 相似，可以刺激机体产生中和抗体，从而达到预防HPV 感染的目的。目前，治疗性疫苗已经进入临床前试验及临床试验阶段，相信终有一天子宫颈癌将不再威胁女性的生命及生存质量。