miR-199a-5p靶向PDCD5基因调控幼年类风湿关节炎软骨细胞的增殖和凋亡

符艺影 许志有 韩 萍 董战玲 郑诗华 王小花

(海口市第三人民医院儿科，海口 571100)

幼年型类风湿关节炎(juvenile rheumatoid arthritis，JRA)是一种以慢性关节炎为主要特征的小儿时期常见的结缔组织病，对儿童危害较大，发病率大约7/10万[1]。近来的研究表明软骨细胞在抑制RA的软骨破坏中具有重要作用[2]，理解软骨细胞增殖和凋亡的分子机制可能为RA的治疗提供新的潜在治疗思路。

研究表明，miR-199a-5p在大鼠脊髓缺血/再灌注损伤(IRI)中表达降低，七氟烷可通过增加miR-199a-5p表达，减少细胞凋亡，保护大鼠脊髓细胞[3]。miR-199a-5p在小鼠肝脏IRI模型中表达明显下调，其能够在缺氧/复氧过程中对细胞起到保护作用[4]。而miR-199a-5p在RA中对软骨细胞是否有保护作用还不清楚。通过TargetScan预测，PDCD5的3′UTR序列中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列，可能是miR-199a-5p的下游靶基因。程序化细胞死亡5(programmed cell death 5,PDCD5)在骨关节炎软骨细胞中表达上调，可能参与骨关节炎软骨细胞的凋亡过程[5]。PDCD5在SD大鼠脑IRI损伤后海马组织中、H/R损伤的心肌细胞和I/R后的心肌细胞中表达升高，抑制PDCD5的表达，可抑制细胞凋亡或增加细胞存活率[6-8]。miR-199a-5p在RA软骨细胞中的表达、对其影响以及miR-199a-5p与PDCD5在RA中的关系还尚未可知。

本课题研究miR-199a-5p影响RA软骨细胞增殖、凋亡的分子机制，并探讨PDCD5在此过程中的作用，以期为RA的临床治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 人RA软骨细胞和人正常软骨细胞由分离培养所得，样本采用海口市第三人民医院骨科10例RA患者行人工关节置换术废弃的关节软骨标本[男6例，女4例，年龄5～9岁，平均年龄(6.1±1.52)岁]和4例因下肢损毁性创伤手术废弃的膝正常关节软骨标本[男2例，女2例，年龄4～10岁，平均年龄(7.0±2.94)岁]，与所有患者家属签订知情同意书，RA患者的临床诊断特征均符合美国风湿病学会标准。

1.1.2主要试剂 高糖DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；胰蛋白酶Trypsin、四氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司；抗PDCD5抗体、抗CyclinD1抗体、抗p21抗体、抗p27抗体、抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗cleaved-caspase3抗体和抗GAPDH抗体购自英国Abcam公司；引物、miR-199a-5p模拟物(miR-199a-5p)、抑制剂(anti-miR-199a-5p)、PDCD5的过表达载体(pcDNA-PDCD5)、干扰物(si-PDCD5)、空载体和阴性对照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及双荧光载体的构建购自上海吉玛制药有限公司；双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司；Ⅱ型胶原酶、TRIzol试剂、real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；流式细胞仪和凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；光学显微镜、全自动酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1软骨细胞分离和培养[9]细胞分离：将上述关节软骨组织置于含1%青-链霉素的PBS溶液中，无菌条件下避开增生骨赘表面的薄层纤维软骨，将软骨组织剪成约1 mm3的软骨块，PBS清洗2遍，收集软骨块，加入约5倍体积的含0.25%胰蛋白酶和10%FBS的DMEM培养液(含1%青-链霉素)，37℃孵育消化30 min，弃消化，加入含0.2%Ⅱ型胶原酶和10%FBS的DMEM培养液(含1%青-链霉素)，37℃摇床振荡消化约16 h，离心，弃上清，用高糖DMEM培养液洗涤3遍，经200目钢网过滤，即为处理好的软骨细胞。

细胞培养：用含10%FBS的高糖DMEM培养液(添加100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素)，在饱和湿度的37℃ 5% CO2培养箱中培养，每48 h换一次培养液，待细胞铺满瓶底或融合度达80%～90%时收集细胞和消化传代。

1.2.2细胞转染 将软骨细胞用培养液稀释至1×106个/ml，接种于6孔板中，细胞培养至融合度达80%～90% 时进行转染。用无血清OptiMEM培养液稀释Lipofectamine 2000、miR-199a-5p模拟物(miR-199a-5p)、抑制剂(anti-miR-199a-5p)、PDCD5的过表达载体(pcDNA-PDCD5)、干扰物(si-PDCD5)、空载体和阴性对照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及双荧光载体，然后取等体积脂质体与等体积各组载体或片段混合，室温孵育20 min，加入培养好的软骨细胞中，混匀后继续培养，6 h后换成完全培养基，转染48 h，收集细胞验证转染效果，进行后续实验。

1.2.3qRT-PCR检测RNA的表达 收集各组软骨细胞，用TRIzol提取细胞总RNA，-80℃保存。然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA，以合成的cDNA为模板，按照 real-time PCR的说明书进行qRT-PCR反应，合成PDCD5 mRNA和miR-199a-5p，反应程序为：95℃5 min；95℃40 s、58℃45 s、72℃45 s，40个循环；72℃10 min。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4MTT实验测定细胞活性 收集培养好的软骨细胞，消化细胞，用培养液稀释细胞为1×104个/ml，按照每孔200 μl细胞/孔接种于96微孔板中，继续培养，分别在24 h、48 h、72 h进行 MTT 实验，每孔加入 20 μl MTT溶液，继续培养4 h，弃上清，然后每孔加入150 μl DMSO，室温振荡孵育10 min，酶标仪测定OD490 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 将转染后的各组软骨细胞培养至对数生长期，用培养液稀释细胞为1×105个/ml，接种于24孔板中，继续培养72 h，收集细胞PBS缓冲液洗涤2次，根据Annexin V/PI kit说明书操作，用100 μl标记缓冲液重悬细胞，然后加入5 μl膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和 10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，室温避光20 min，加入400 μl标记缓冲液，用流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。

1.2.6双荧光素酶报告系统实验 按照1.2.2的方法将构建好的PDCD5野生型(WT-PDCD5)和突变型(MUT-PDCD5)双荧光素酶报告载体，然后分别与miR-NC或miR-199a-5p共转染培养好的软骨细胞，转染后培养48 h，收集细胞，加入裂解缓冲液，室温裂解20 min，离心收集上清，加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.2.7Western blot实验 收集各组软骨细胞，加入RIPA裂解液，室温裂解30 min，超声破碎细胞，离心收集蛋白，检测蛋白浓度。然后进行SDS-PAGE，转PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗，抗CDCA5抗体(1∶1 000)、CyclinD1抗体(1∶1 000)、p21抗体(1∶1 000)、p27抗体(1∶1 500)、抗Bcl-2抗体(1∶1 000)、抗Bax抗体(1∶1 200)、抗cleaved-caspase3抗体(1∶1 000)和抗GAPDH抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜。洗膜2次，然后加入稀释的二抗，室温孵育2 h。以GAPDH为内参照，分析蛋白水平。

2 结果

2.1miR-199a-5p和PDCD5在RA软骨细胞和正常软骨细胞中的表达 qRT-PCR和Western blot结果表明，与normal组相比，在RA组软骨细胞中miR-199a-5p的表达量显著降低(P<0.05)，而PDCD5 mRNA和蛋白表达量则显著升高(P<0.05)，见图1。

2.2miR-199a-5p过表达可促进RA软骨细胞增殖 结果表明，与normal组相比，RA组miR-199a-5p表达量下降(P<0.05)，促增殖蛋白CyclinD1表达下降(P<0.05)，增殖负调控蛋白p21和p27表达量上升(P<0.05)，软骨细胞增殖活性显著下降(P<0.05)；与RA+miR-NC组相比，RA+miR-199a-5p组的miR-199a-5p表达量显著升高(P<0.05)，CyclinD1表达上升(P<0.05)，p21和p27表达量降低(P<0.05)，软骨细胞增殖活性显著升高(P<0.05)，见图2。

2.3过表达miR-199a-5p可抑制RA软骨细胞凋亡 流式细胞术和Western blot结果表明，与normal组相比，RA组软骨细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表达量上升(P<0.05)；与RA+miR-NC组相比，RA+miR-199a-5p组软骨细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表达量降低(P<0.05)，见图3。

2.4抑制PDCD5表达可促进RA软骨细胞增殖和抑制细胞凋亡 结果表明，与normal组相比，RA组的PDCD5蛋白表达量显著升高(P<0.05)，CyclinD1表达降低(P<0.05)，p21表达量升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表达量上升(P<0.05)，细胞增殖活性降低(P<0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)；与RA+si-NC组相比，RA+si-PDCD5组的PDCD5蛋白表达量降低(P<0.05)，CyclinD1表达升高(P<0.05)，p21表达量降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表达量降低(P<0.05)，细胞增殖活性升高(P<0.05)，凋亡率显著降低(P<0.05)，见图4。

图1 miR-199a-5p和PDCD5在RA软骨细胞和正常软骨细胞中的表达Fig.1 Expression levels of miR-199a-5p and PDCD5 in RA chondrocytes and normal chondrocytesNote: A.Expression levels of miR-199a-5p in RA chondrocytes and normal chondrocytes；B.Expression levels of PDCD5 mRNA in RA chondrocyte and normal chondrocytes；C and D.Expression levels of PDCD5 protein in RA chondrocyte and normal chondrocytes,*.P<0.05 vs Normal group.

图2 过表达miR-199a-5p对RA软骨细胞增殖的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-199a-5p on proliferation of RA chondrocytesNote: A.Relative expression of miR-199a-5p in RA chondrocyte；B.Effect of overexpression of miR-199a-5p on proliferation of RA chondrocytes；C and D.Effect of overexpression of miR-199a-5p on the expression of proliferation-related proteins in chondrocytes,*.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs RA+miR-NC group.

图3 miR-199a-5p过表达对RA软骨细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of overexpression of miR-199a-5p on apoptosis of RA chondrocytesNote: A.Flow cytometry was used to detect apoptosis of chondrocyte；B.Effects of overexpression of miR-199a-5p on cell apoptosis in RA chondrocyte；C and D.Effect of miR-199a-5p overexpression on the expression of apoptosis-related proteins in RA chondrocytes,*.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs RA+miR-NC group.

2.5miR-199a-5p靶向调控PDCD5的表达 通过Targetscan预测结果发现，PDCD5的3′UTR序列中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列，见图5A。

图4 过表达PDCD5对RA软骨细胞增殖、凋亡的影响Fig.4 Effects of overexpression PDCD5 on proliferation and apoptosis of RA Note: A.Expression levels of proteins in chondrocyte detected by Western blot；B.Relative expression of PDCD5 protein in RA chondrocyte；C and D.Effects of inhibition of PDCD5 on cell proliferation and the expression of proliferation-related proteins in RA chondrocyte；E and F.Effects of inhibition of PDCD5 on cell apoptosis and the expression of apoptosis-related proteins in RA chondrocyte,*.P<0.05 vs miR-NC group；#.P<0.05 vs RA+si-NC group.

图5 miR-199a-5p和PDCD5在RA软骨细胞中的调控关系Fig.5 Regulatory relationship between miR-199a-5p and PDCD5 in RA Note: A.The sequence of PDCD5 3′UTR contains complementary nucleotide sequences with miR-199a-5p；B.Dual luciferase reporter assay；C and D.miR-199a-5p regulates the expression of PDCD5 protein,*.P<0.05 vs miR-NC group,#.P<0.05 vs anti-miR-NC group.

双荧光素酶报告系统结果如图5B所示，与miR-NC组相比，miR-199a-5p组野生型WT-PDCD5的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型MUT-PDCD5的萤火虫荧光素酶相对活性没有显著变化。Western blot结果发现，与miR-NC组相比，miR-199a-5p组的PDCD5表达量显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-199a-5p组的PDCD5表达量显著上升(P<0.05)，见图5C、D。

图6 过表达PDCD5逆转了miR-199a-5p过表达对RA软骨细胞增殖和凋亡的影响Fig.6 Overexpression of PDCD5 reversed effect of miR-199a-5p overexpression on proliferation and apoptosis of RA chondrocytesNote: A.Expression levels of proteins in chondrocyte detected by Western blot；B.Relative expression of PDCD5 protein in RA chondrocyte；C and D.Overexpression of PDCD5 reversed the effects of miR-199a-5p overexpression on proliferation and the expression of proliferation-related proteins of RA chondrocyte；E and F.Overexpression of PDCD5 reversed the effects of miR-199a-5p overexpression on apoptosis and the expression apoptosis-related proteins of RA chondrocyte.*.P<0.05 vs RA+miR-NC group；#.P<0.05 vs RA+miR-199a-5p+pcDNA group.

2.6PDCD5过表达逆转了miR-199a-5p过表达对RA软骨细胞增殖和凋亡的作用 结果显示，与RA+miR-NC组相比，RA+miR-199a-5p组软骨细胞中PDCD5表达量显著下降(P<0.05)，增殖相关蛋白CyclinD1表达升高(P<0.05)，p21表达下降(P<0.05)，细胞增殖活性显著升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表达下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与RA+miR-199a-5p+pcDNA组相比，RA+miR-199a-5p+pcDNA-PDCD5组PDCD5表达量显著升高(P<0.05)，CyclinD1表达下降(P<0.05)，p21表达升高(P<0.05)，细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表达升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图6。

3 讨论

JRA比成人RA具有更多、更突出的全身症状，导致约20%患者关节永久损害和严重残疾[10]，软骨和骨组织的结构损伤以及由此造成的关节破坏是RA的一个显著特征[11]，阐明软骨损伤和修复机制有助于理解RA发病机制，也有助于改进现有的诊断和治疗方法。

大量研究表明，miRNAs在RA患者的外周血、滑膜组织、滑膜成纤维细胞和滑膜液中异常表达，参与调控RASFs的增殖、凋亡和侵袭[12]，但在软骨细胞中的研究较少。miR-199a在人恶性肿瘤中异常表达，miR-199a-5p在大鼠脑缺血再灌注损伤和大鼠溃疡性结肠炎中表达上调，药物可通过下调miR-199a-5p改善炎症损伤[13-15]。miR-199a-5p在中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病的多发性硬化(mulitple sclerosis，MS)患者血清中表达下调，可能作为MS患者复发鉴别的诊断指标[16]。有研究表明，在中药治疗的骨关节炎的关节软骨中miR-199a-5p表达升高[17]。miR-199a-5p在RA中的表达情况和作用尚不清楚。本研究结果发现，在JRA软骨细胞中miR-199a-5p表达量显著降低，过表达miR-199a-5p可促进JRA软骨细胞增殖，抑制JRA软骨细胞凋亡，说明miR-199a-5p在JRA中具有重要作用。

本研究通过生物信息学预测发现，PDCD5的3′UTR中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列，提示miR-199a-5p与PDCD5之间可能存在结合位点或调控关系，PDCD5在RA中可能也有调控作用。PDCD5在细胞凋亡和旁体细胞死亡中起重要作用，在培养基中添加外源重组PDCD5也能增强特定刺激引起程序性细胞死亡[18]。有研究表明，PDCD5还可通过PDCD5-TIP60-FOXP3通路促进调节T细胞功能，参与免疫调节[19]。Wang等[20]发现，PDCD5在RA患者血浆和滑膜液中表达上调，与滑膜液中TNF-α表达呈负相关，在血浆中与C反应蛋白和血沉呈负相关。RA患者血清和滑膜液中PDCD5水平与IL-17水平呈负相关[21]，过表达PDCD5可促进雷公藤甲素诱导的RA成纤维样滑膜细胞凋亡，PDCD5影响RA发病机制[22]。本研究结果发现，PDCD5在JRA软骨细胞中表达上调，抑制PDCD5表达可促进JRA软骨细胞增殖并抑制凋亡，与上述结果呼应[22]。

本研究通过双荧光素酶报告系统和Western blot进一步确认，miR-199a-5p靶向调控PDCD5的表达，过表达PDCD5逆转了miR-199a-5p过表达对软骨细胞增殖和凋亡的作用，验证了两者在JRA软骨细胞中的调控关系。

本研究阐述了miR-199a-5p在JRA软骨细胞靶向调控PDCD5的表达，影响软骨细胞增殖和凋亡，在JRA发病机制中具有重要作用。综上，本研究为JRA分子靶向治疗提供了新的研究方向，miR-199a-5p和PDCD5有望成为JRA潜在治疗靶点。