miR-152在IL-6诱导宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭中的作用及其机制

徐书方 刘立秋 张玉清 张 艳 孙月菊 范 星 苗莉娜 李 娟

(石家庄医学高等专科学校，石家庄 050599)

宫颈癌是威胁女性身体健康的常见恶性肿瘤，而持续性人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染导致的微环境异常引起慢性炎症是宫颈癌发生发展的重要原因[1]。IL-6是肿瘤微环境的主要炎症介质之一，可由单核巨噬细胞和活化的淋巴细胞等产生，在机体免疫应答和炎症反应过程中发挥重要作用，其异常表达能够刺激宫颈癌细胞异常增殖和转移[2-4]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类在肿瘤发生发展过程中发挥致癌或抑癌作用的内源性非编码RNA分子，可与靶基因3′非编码(UTR)区域结合影响靶基因的降解或翻译，进而影响细胞增殖、凋亡和转移等生物学过程。miR-152是于miR-148/152家族成员，在乳腺癌、卵巢癌和口腔鳞癌等肿瘤中异常表达，可通过调控细胞增殖和侵袭发挥抑癌作用[5-7]。有研究证实，IL-6可抑制胆管癌和胃癌细胞中miR-152表达促进肿瘤细胞的异常增殖和转移[8,9]，但miR-152是否参与IL-6诱导的宫颈癌细胞增殖和侵袭并不清楚。因此，本研究以重组人IL-6处理宫颈癌Hela细胞，旨在阐明miR-152在IL-6诱导Hela细胞增殖和侵袭中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 人宫颈癌Hela细胞株购于中科院上海细胞库，胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI1640培养基购于美国Hyclone公司，重组人IL-6购于美国Peprotech公司，ECL显影液、CCK-8试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于碧云天生物技术公司，Trizol试剂、逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司，Matrigel胶购于美国BD公司，PVDF膜和Transwell小室购于美国Millipore公司，WNT1、β-catenin、GAPDH抗体购于美国Santa Cruz公司，MMP-9、CyclinD1抗体购于美国Abcam公司，脂质体2000购于美国LifeTech公司，miR-152模拟物及其阴性对照购于广州锐博生物公司。

1.2方法

1.2.1Hela细胞培养 采用37℃水浴锅经冻存的Hela细胞快速解冻后，将细胞液转移至离心管中，加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI1640完全培养基，1 000 r/min离心5 min后，弃上清液。再加入RPMI1640完全培养基重悬细胞，并将其转移至培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。每隔1 d更换新鲜培养液，待细胞铺于瓶底时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。取第3～5代对数生长期Hela细胞用于后续实验。

1.2.2CCK-8法检测Hela细胞增殖 将对数生长期Hela细胞以1×106个/孔接种至96孔细胞板上，于细胞培养箱中常规培养24 h，加入终浓度为0.5、5和50 ng/ml IL-6，另外以加入等量培养液的细胞作为对照(0 mg/ml)组，每组设置3个复孔。置于细胞培养箱中常规培养24 h、48 h和72 h后，弃上清。参照CCK-8试剂盒说明书加入10 μl CCK-8试剂孵育2 h。采用酶标仪检测各组细胞在570 nm处的光密度OD值。

1.2.3Transwell法检测Hela细胞侵袭 将对数生长期的Hela细胞种植于24孔板，然后置于细胞培养箱内常规培养过夜。以0、0.5、5和50 ng/ml IL-6分别处理细胞24 h。使用50 μl浓度为50 mg/L Matrigel基质胶对Transwell小室底部膜的上室面进行包被，并放于细胞培养箱中融合1 h。收集IL-6处理后的各组细胞，使用无血清培养基重悬细胞并使细胞浓度为1×105个/ml。取100 μl细胞悬液加入到Transwell小室上室中，并于下室内加入含血清的培养液600 μl。置于细胞培养箱中常规培养24 h后，将小室取出。小心拭去上室内的细胞与基质胶后，以甲醛对小室膜底固定15 min，并以0.5%结晶紫染色15 min。经双蒸馏水漂洗后，晾干。采用显微镜观察并统计各组中的穿膜细胞数，结果以随机选取的5个视野中穿膜细胞数的均值表示。

1.2.4RT-PCR检测Hela细胞中miR-152的表达 收集IL-6处理48 h的各组Hela细胞，加入1 ml Trizol试剂提取总RNA，并使用超微量紫外可见分光光度计对总RNA的浓度与纯度进行测量。参照逆转录试剂盒说明书步骤将RNA进行逆转录，以逆转录产物作为模板，根据上海生工生物公司合成的引物，配制总体积为20 μl的PCR反应体系，按照(94℃预变性5 min后，进入40个循环：94℃ 变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s)扩增程序进行PCR扩增。以U6为内参，2-ΔΔCt法评估各组细胞中miR-152的表达水平。

1.2.5Western blot检测Hela细胞中WNT/β-catenin信号通路相关蛋白的表达 参照总蛋白提取试剂盒说明书步骤抽提Hela细胞总蛋白，并使用BCA法检测蛋白浓度。以4∶1比例在蛋白样品中加入5×Loading buffer，混匀后沸水浴中变性5 min。将变性蛋白按照每泳道80 μg加入到SDS-PAGE凝胶中，以100 V电压电泳，溴酚蓝接近分离胶底部时终止电泳，再以350 mA恒流转膜。将PVDF膜用TBST稀释的5%脱脂奶粉封闭1.5 h后，加入TBST稀释1 000倍的特异性一抗(WNT1、β-catenin、CyclinD1、MMP-9和GAPDH抗体)，于4℃孵育过夜。再以TBST稀释5 000倍的二抗室温孵育1 h。暗盒中，滴加ECL底物显色液显影定影后，凝胶成像仪拍照，Image J 软件分析目的条带的灰度值，并以GAPDH为内参规范各目的蛋白的表达水平。

1.2.6Hela细胞转染 将对数生长期的Hela细胞种植于6孔板上，并在细胞培养箱内常规培养至70%融合度时，根据转染试剂脂质体2000说明书步骤将miR-152模拟物及其阴性对照分别转至Hela细胞中，转染24 h后给予50 ng/ml IL-6处理24 h，并分别标记为IL-6+miR-152组、IL-6+miR-NC组，另将未经任何处理的Hela细胞作为对照组，将只给予50 ng/ml IL-6处理而未转染的Hela细胞作为IL-6组。待处理结束后，分别采用CCK-8法、Transwell法、RT-PCR和Western blot检测各组细胞增殖、侵袭能力以及各组细胞中miR-152表达水平和WNT/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验检测miR-152和WNT1的靶向关系 使用TargetScan、miRanda及miRBase三大靶基因预测数据库预测miR-152与WNT1 3′UTR区域存在互补的核苷酸序列。构建野生型(WNT1-WT)和突变型(WNT1-MUT)WNT1 3′UTR荧光素酶载体，参照脂质体2000说明书步骤将WNT1-WT和WNT1-MUT分别与miR-152模拟物及其阴性对照共转染，并分别标记为miR-152+WNT1-WT组、miR-NC+WNT1-WT组、miR-152+WNT1-MUT组、miR-NC+WNT1-MUT组。转染48 h后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组细胞的荧光素酶活性。

2 结果

2.1IL-6诱导宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭 与对照组(0 ng/ml)相比，0.5、5和50 ng/ml IL-6处理后Hela细胞在24～72 h的增殖能力明显增强(P<0.05)；同时，不同浓度IL-6处理组中侵袭细胞数较对照的均明显升高(P<0.05)；且细胞增殖和侵袭能力均呈现IL-6浓度依赖性。见图1。

2.2IL-6下调宫颈癌Hela细胞中miR-152表达 以0、0.5、5和50 ng/ml IL-6处理后Hela细胞中miR-152的表达量分别为1.00±0.06、0.82±0.05、0.68±0.03和0.46±0.03，各组间miR-152表达水平差异有统计学意义(F=78.987，P=0.000)。与对照(0 ng/ml)相比，IL-6处理组中miR-152表达水平显著降低(P<0.05)，且IL-6浓度越大Hela细胞中miR-152的表达越低。

2.3IL-6促进宫颈癌Hela细胞中WNT/β-catenin信号通路活化 进一步检测发现，随着IL-6作用浓度的增加，Hela细胞中WNT/β-catenin信号通路关键蛋白WNT1、β-catenin及下游蛋白CyclinD1和MMP-9的表达水平均显著升高，与对照组(0 ng/ml)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.4WNT1是miR-152的靶基因 采用生物信息学软件预测到WNT1 3′ UTR区域与miR-152存在互补的核苷酸序列，见图3A。双荧光素报告基因实验检测结果显示，与miR-NC+WNT1-WT组相比，miR-152+WNT1-WT组细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，miR-152可与WNT1 3′ UTR靶向结合；miR-152+WNT1-MUT组细胞的荧光素酶活性与miR-NC+WNT1-MUT组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图3B。

2.5miR-152过表达逆转IL-6对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭以及WNT/β-catenin信号通路的调控 与对照组相比，IL-6组Hela细胞中miR-152表达水平显著降低，而细胞增殖、侵袭能力以及细胞中WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)；与IL-6组相比，IL-6+miR-NC组差异无统计学意义(P>0.05)，而IL-6+miR-152组中miR-152表达水平显著升高，细胞增殖、侵袭能力以及细胞中WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。成功上调miR-152表达后，IL-6对Hela细胞增殖侵袭的促进以及对WNT/β-catenin信号通路的调控作用均得到显著逆转。见图4。

图1 不同浓度IL-6对Hela细胞增殖和侵袭的影响Fig.1 Effects of different concentrations of IL-6 on proliferation and invasion of Hela cellsNote: A.OD value of Hela cells stimulated by IL-6 at different times;B.The colony formation rate of Hela cells after IL-6 stimulation;C.The invasion of Hela cells after IL-6 stimulation.Compared with 0 ng/ml,*.P<0.05.

图2 不同浓度IL-6对Hela细胞中WNT1/β-catenin信号通路的影响Fig.2 Effects of different concentrations of IL-6 on WNT1/β-catenin signaling pathway in Hela cellsNote: A.Expression of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein by Western blot;B.Expression level of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein.Compared with 0 ng/ml,*.P<0.05.

图3 miR-152与WNT1靶向关系的验证Fig.3 Verification of targeting relationship between miR-152 and WNT1Note: A.The binding site of WNT1 3′ UTR and miR-152;B.The luciferase activity of each group of cells.Compared with the miR-NC+WNT1-WT group,*.P<0.05.

图4 miR-152过表达对Hela细胞中WNT/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of miR-152 overexpression on expression of WNT/β-catenin signaling pathway-related proteins in Hela cellsNote: A.The relative expression level of miR-152;B.The OD value;C.The number of invading cells;D.The result of Western blot;E.The expression level of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with IL-6 group,#.P<0.05.

3 讨论

慢性炎症是肿瘤发生发展过程中的重要事件，IL-6作为一种重要的炎症因子，可通过激活PI3K/Akt、Stat3/Nrf2和NF-κB信号通路等参与肿瘤细胞增殖、迁移和上皮间质转化等生物学过程[9-11]。IL-6被证实在宫颈癌患者外周血中呈现高表达，且与宫颈癌的发生、发展及HR-HPV感染密切相关[12]。文献报道指出，以外源性IL-6处理宫颈癌细胞后可促进癌细胞增殖、迁移、上皮-间质转化和侵袭[4,13]。本研究以重组人IL-6刺激宫颈癌Hela细胞后进一步证实了上述IL-6诱导宫颈癌细胞增殖和侵袭的研究结果。此外，本研究还发现IL-6刺激可抑制Hela细胞中miR-152表达。这提示miR-152可能在IL-6诱导的宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭过程中发挥着重要作用。

miR-152是一个与肿瘤发生发展密切相关的miRNA，可通过调控细胞增殖、迁移、侵袭和周期进展等在包括结肠癌、胶质瘤和胃癌等多种肿瘤中发挥着抑癌基因的作用[14-16]。有研究指出，miR-152在宫颈癌组织和细胞中表达下调，可通过靶向KLF5抑制细胞增殖和细胞周期的进展[17]。另外，文献证实在IL-6诱导胃癌MGC-803增殖、迁移和上皮间质转化过程中miR-152表达下调是其重要的分子机制[9]。本研究通过转染miR-152模拟物成功上调miR-152表达后发现，IL-6诱导的Hela细胞增殖、侵袭均受到明显抑制。结果表明，miR-152参与IL-6诱导的宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭过程。

WNT/β-catenin信号通路是细胞内Wnt信号传导的经典途径，其异常活化与包括宫颈癌在内的多种肿瘤发生发展关系密切；当WNT信号激活后，β-catenin在胞浆中聚集，使β-catenin进入细胞核，进而激活下游靶基因的表达，导致细胞异常增殖和转移[18,19]。有研究指出，IL-6可通过激活WNT/β-catenin信号通路促进结肠癌细胞侵袭和转移。本研究以IL-6刺激宫颈癌Hela细胞后发现，Hela细胞中WNT/β-catenin信号通路关键分子WNT1、β-catenin以及下游靶基因CyclinD1和MMP-9的表达水平均明显升高[20]。这提示IL-6可能通过激活WNT/β-catenin信号通路诱导Hela细胞增殖和侵袭。

为进一步探讨miR-152参与IL-6诱导的宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的分子机制，本研究采用靶基因预测软件对miR-152潜在靶基因进行预测。结果发现，miR-152与WNT1 3′UTR存在互补的结合位点，同时双荧光素酶报告基因实验证实miR-152可与WNT1 3′ UTR靶向结合。另外，成功上调miR-152表达后，IL-6诱导的WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表达水平均明显受到抑制。有研究发现，在骨肉瘤的研究中miR-152可通过靶向Wnt/β-catenin信号通路抑制癌细胞增殖[21]。结果提示，miR-152可通过靶向调控WNT/β-catenin信号通路参与IL-6诱导的宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭。

综上所述，IL-6可通过下调miR-152表达，诱导其靶基因WNT1表达，进而激活WNT/β-catenin信号通路，诱导宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭过程，从而促进宫颈癌的发生发展。该结果进一步阐述了宫颈癌发生发展的分子机制，也为进一步寻找宫颈癌治疗靶点提供了方向。