小鼠卵泡内M-CSF和NPPC的表达情况及相互影响

刘畅 张治芬

雌性哺乳动物卵巢规律排卵是正常生殖繁衍的前提，而卵巢卵母细胞发育始于胚胎期，于出生时停滞在减数分裂前期，直至青春期后月经中期排卵前黄体生成素（luteotropic hormone，LH）峰解除阻滞[1]后，减数分裂才能恢复。近年研究普遍认为LH峰解除阻滞后，卵泡内由C型尿钠肽前体（natriuretic peptide precursor type C，NPPC）编码的 C 型尿钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）表达下降，经由一系列信号传导通路使卵母细胞内的环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平下降，从而使卵母细胞减数分裂恢复继而排卵。LH受体位于壁层颗粒细胞，卵丘颗粒细胞和卵母细胞缺乏LH受体[2]，因此，LH触发卵母细胞成熟的机制是间接的，即LH作用于卵泡的壁层颗粒细胞后，其信号必须从壁层颗粒细胞向卵母细胞传导，而其中信号传导路径值得我们深入研究。

巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）作为一种特异性生长因子，参与调节巨噬细胞的增殖、分化和迁移。一些研究也发现MCSF参与了卵泡生长发育成熟及排卵过程[3-4]，但其在LH峰后表达水平的变化曲线尚未知。因此，本研究通过培养小鼠卵泡并进行不同干预，检测各个时间点小鼠卵泡内M-CSF及其受体（M-CSFR）和NPPC mRNA表达水平，观察M-CSF、M-CSFR对NPPC表达的影响，探讨其是否参与减数分裂恢复中的信号传导。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立 SFP级雌性青春期前（25d龄）C57BL/6小鼠5只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证号SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江省医学科学院动物中心[实验动物许可证号码SYXK（浙）2014-0008]。小鼠腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素促进卵泡发育，48h后处死小鼠。动物饲养和实验操作过程符合《实验动物饲养管理和使用指南》的规定。

1.2 成熟卵泡细胞的分离与培养 切取小鼠卵巢，去除周围脂肪组织，置于37℃ MEMα培养液（含2mmol/L谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和100mg/ml胎牛血清）中。将卵巢对半剖开，半球形朝上放置，在卵巢半球顶部挤压，卵泡可在半球周边释放出来。仔细收集排卵前卵泡，每个卵巢可分离10～15个卵泡。将搜集的卵泡随机分为空白对照组、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）组、M-CSF组、GW2580组和M-CSF+GW2580组5组，转移至盛有不同培养液的四孔板中，空白对照组为MEMα培养液，HCG组为MEMα培养液中滴入HCG 5IU，M-CSF组为MEMα培养液中加入M-CSF 200ng/ml，GW2580组为MEMα培养液中加入M-CSFR阻滞剂GW2580 1μmol/L，M-CSF+GW2580组为MEMα培养液中同时加入MCSF 200ng/ml及 GW2580 1μmol/L，置于 37℃、5%CO2温箱中培养。

1.3 卵泡内M-CSF、M-CSFR及NPPC mRNA表达水平检测 培养0.5、1、2、4h时收集空白对照组、HCG组、M-CSF组的卵泡，采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法检测空白对照组和HCG组小鼠卵泡中M-CSF、MCSFR和NPPC mRNA表达水平以及M-CSF组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平。在培养2h时收集GW2580组和M-CSF+GW2580组的卵泡，采用荧光定量PCR法检测小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平。荧光定量PCR法具体如下：采用Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，并逆转录为cDNA。采用SYBR Green荧光染料荧光定量PCR法扩增，20μl体系（SYBR荧光染料10μl、上下游引物各0.5μl、DEPC 水 8μl、cDNA 1μl）。内部参照管家基因选择 Rpl19。引物设计采用Rrimer Primer 5.0软件包，具体设计信息见表1。扩增条件为95℃预变性30s，随后95℃ 5s，60℃20s，40 个循环，采用相对定量 2-ΔΔCt计算基因表达水平。所有检测至少进行3次。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内不同时间点比较采用重复测量数据的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空白对照组和HCG组小鼠卵泡中M-CSF和MCSFR mRNA表达水平比较 空白对照组小鼠卵泡中M-CSF和M-CSFR mRNA表达水平均呈上升趋势，培养2、4h时M-CSF mRNA表达水平均较培养0.5、1h时升高，培养1、2、4h时M-CSFR mRNA表达水平均较0.5h升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中培养1h与2h的M-CSFR mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而HCG组小鼠卵泡中M-CSF和MCSFR mRNA均呈低水平表达，组内不同时间点比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。空白对照组和HCG组小鼠卵泡培养2、4h时M-CSF mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均 P＜0.05），培养 1、2、4h 时 M-CSFR mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 1-2。

表1 引物序列

图1 空白对照组和HCG组小鼠卵泡中M-CSF mRNA表达水平比较

图2 空白对照组和HCG组小鼠卵泡中M-CSFR mRNA表达水平比较

2.2 空白对照组、HCG组和M-CSF组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平比较 空白对照组小鼠卵泡不同时间点NPPC mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而HCG组和M-CSF组小鼠卵泡培养2h时NPPC mRNA表达水平均有不同程度的升高，与组内其他时间点比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），并在培养2h时达到峰值，随即下降；培养2h时HCG组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平明显高于空白对照组和M-CSF组，M-CSF组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见图 3。

2.3 各组小鼠卵泡培养2h时NPPC mRNA表达水平比较 GW2580组、M-CSF+GW2580组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平与空白对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），而与空白对照组比较，HCG组NPPC mRNA明显升高，M-CSF组NPPC mRNA轻度升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图3 空白对照组、HCG组和M-CSF组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平比较

图4 各组小鼠卵泡培养2h时NPPC mRNA表达水平比较

3 讨论

M-CSF是由单核吞噬细胞产生的一种特异性生长因子，属于造血因子，分子质量为40～90ku，其基因位于第5号染色体上，与其相应受体结合后发挥生物学作用。M-CSFR是c-fms原癌基因编码的跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族。1992年Arceci等[3]研究发现妊娠期输卵管及子宫均表达M-CSF，并在卵母细胞、着床前胚胎和胎盘中亦可检测到M-CSFR的表达。由此发现MCSF及其受体在生殖系统中的作用。随后有研究发现M-CSF基因缺失小鼠发情周期延长，成熟卵泡减少，排卵率降低，而给予补充M-CSF后可逆转上述改变[4]，该研究证实了M-CSF在卵泡发育成熟及排卵中的重要作用。在卵泡发育早中期，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）刺激颗粒细胞分泌雌激素（estradiol，E2）和M-CSF，而E2水平增加后反过来刺激卵泡内颗粒细胞和巨噬细胞分泌M-CSF，故推测FSH对卵泡发育和成熟的调节作用部分通过M-CSF及其受体通道完成[5]。卵泡内不断升高的M-CSF水平诱导较多巨噬细胞进入卵泡内，而巨噬细胞分泌因子在调节卵母细胞生长、激素合成、排卵、颗粒细胞增殖与分化方面都有重要作用。然而LH/HCG峰后减数分裂重新启动的信号传导通路中M-CSF的具体作用机制尚未知。本研究取促排卵小鼠模型卵巢内卵泡进行培养，通过改变卵泡培养基成分，探索M-CSF及其受体M-CSFR对NPPC mRNA的影响，结果显示空白对照组M-CSF、M-CSFR mRNA表达水平呈上升趋势，而HCG组M-CSF、M-CSFR mRNA均呈低水平表达。Zhang等[6]研究显示卵泡发育过程中，血清M-CSF及其受体表达呈上升趋势并在排卵日达到峰值，而卵泡内M-CSF水平远高于血清。因此，在未干预的情况下，卵泡内各种类固醇激素、细胞因子、蛋白激酶等互相作用保持卵泡处于逐渐发育成熟的状态，MCSF及其受体表达继续呈上升趋势。而HCG组，在HCG的刺激下，M-CSF、M-CSFR均呈低表达状态，提示LH/HCG峰后，卵泡内M-CSF及其受体表达明显下降，继而影响到血清浓度。既往有研究体外培养黄素化颗粒细胞，发现其E2表达与颗粒细胞分泌的M-CSF水平呈正相关[6]，故推测LH峰后M-CSF及其受体表达下降与E2水平下降有关。

国内外研究均证实小鼠排卵前LH峰可抑制卵巢颗粒细胞分泌CNP，减少CNP与其受体结合，降低cGMP的合成，从而促进排卵前卵母细胞的成熟和减数分裂的恢复[7]。有研究指出LH峰后2～3h可见卵泡内CNP明显下降[8]，这与本研究结果一致。本研究空白对照组小鼠卵泡中NPPC mRNA表达水平未见明显增减，而HCG组可见其先逐步上升后快速下降，并在2h达到峰值。此外M-CSF组NPPC变化曲线与HCG组相类似，而GW2580组和M-CSF+GW2580组NPPC mRNA表达水平与空白对照组比较未见明显差异，均未见NPPC mRNA表达水平明显增减，由此推测LH/HCG峰通过抑制卵泡内M-CSF及其受体表达，导致卵泡内NPPC水平上升至峰值后下降，继而影响cGMP及环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，最终导致卵母细胞减数分裂恢复及排卵的发生。而M-CSF组2h时NPPC峰值明显低于HCG组，考虑存在以下3种可能性：（1）M-CSF作为LH/HCG的下游因子，其作用效能低于HCG；（2）本研究培养基中加入了 M-CSF 200ng/ml，提高M-CSF浓度可能导致NPPC峰值升高；（3）卵母细胞生发泡破裂所需的NPPC阈值尚未知，对此，我们可以进一步研究不同浓度M-CSF对卵泡内NPPC表达的影响，探索生发泡破裂所需的卵泡内NPPC阈值浓度。

综上所述，M-CSF作为一种特异性生长因子，在卵泡发育和成熟及减数分裂恢复中起到重要作用。排卵前LH峰可能通过抑制卵泡内M-CSF及其受体表达，而使卵泡内NPPC水平上升至峰值后快速下降，继而影响cGMP及cAMP水平，最终导致卵母细胞减数分裂恢复及排卵的发生。