多奈哌齐未能改善APP/PS1-AD转基因小鼠学习记忆功能的机制研究

周彬彬 张慧敏 朱文烽 孙登学 崔孟军 张俊 向超 朱军旗 蒋正立

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称为老年性痴呆症，是一种以渐进性记忆障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，其主要病理特征是脑内胆碱能神经元丢失和 β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉积[1]。2018年9月国际AD协会报道，2018年全球大约有5 000多万痴呆患者，其中2/3是AD患者，并预测到2050年，患者人数将增加3倍[2]，AD给患者及其家庭造成沉重的精神和经济负担，AD的预防和治疗成为当下急需解决的医疗和社会问题。各国痴呆诊疗指南均推荐胆碱酯酶抑制剂作为一线治疗药物，而胆碱酯酶抑制剂也在临床中使用最为广泛，代表性药物为多奈哌齐[3-4]。APP/PS1-AD转基因小鼠是目前最常用的评价AD治疗药物药效以及考察药物作用机制的动物模型。在前期研究中，本实验组选用9月龄APP/PS1-AD转基因小鼠，经Morris水迷宫实验、跳台实验初步证实多奈哌齐并不能有效改善该模型小鼠记忆功能[5]，因此本实验将进一步探讨多奈哌齐未能有效改善APP/PS1-AD转基因小鼠记忆功能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 9月龄雄性APP/PS1-AD转基因小鼠80只、同龄野生型小鼠20只均购自南京大学模式动物研究所（合格证号：0022834，201400204），并于 SPF 级动物房饲养，光照时间为 8:00～20:00，室温 20～26℃，湿度40%～70%。饲养期间小鼠自由进食和饮水，手术前后单独饲养。

1.2 实验器材及试剂 显微镜（NIB900-FL）购自上海维翰光电科技有限公司；乙酰胆碱酯酶活性测定试剂盒（批号：20150109）购自南京建成生物工程研究所；Aβ42ELISA试剂盒（批号：1433908C）购自美国Life Technologies公司；全血、血清多元素检测试剂盒（改进型）购自北京博晖创新生物技术股份有限公司；6E10抗体（批号：08IC01727）购自上海Covance公司；多奈哌齐购自日本卫才制药公司，多奈哌齐溶液以蒸馏水为溶媒，现用现配，配制终浓度分别为0.1、0.3和0.6mg/ml，给药剂量按小鼠每10g体重0.1ml给药。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将APP/PS1-AD转基因小鼠按随机数字表法分为转基因小鼠对照组、转基因小鼠多奈哌齐1mg/kg组、转基因小鼠多奈哌齐3mg/kg组和转基因小鼠多奈哌齐6mg/kg组，每组20只，并以20只同龄野生型小鼠作为野生型小鼠对照组。饲养期间小鼠自由进食和饮水，手术前后单独饲养。饲料购于军事医学科学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK-（军）2002-001。

1.3.2 给药方式 转基因小鼠多奈哌齐1mg/kg组、转基因小鼠多奈哌齐3mg/kg组和转基因小鼠多奈哌齐6mg/kg组灌胃给药1次/d，每周连续5d，持续12周，直至实验结束。转基因小鼠对照组和野生型小鼠对照组灌胃给予等量饮用水。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠大脑皮层和海马组织中乙酰胆碱酯酶活性比较 转基因小鼠对照组与野生型小鼠对照组大脑皮层组织中乙酰胆碱酯酶活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），但转基因小鼠多奈哌齐各剂量组大脑皮层组织中乙酰胆碱酯酶活性均明显低于野生型小鼠对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。各组小鼠大脑海马组织中乙酰胆碱酯酶活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

2.2 各组小鼠大脑皮层和海马组织中Aβ42含量比较

1.3.3 动物组织处理 行为学实验结束后，干冰麻醉动物，依次剪开小鼠皮肤、胸腔，充分暴露心脏，剪开心包膜，剪开右心耳，从左心室方向快速输注TBS溶液30ml至流出液变清。然后断头取脑，冰上分离皮层和海马，-80℃冰箱保存。部分小鼠大脑放入4%多聚甲醛溶液中继续固定3h后转入10%蔗糖溶液中过夜，第2天换至20%蔗糖溶液中，8h后移入30%蔗糖溶液中。OCT包埋，随后进行冰冻切片，厚度20μM，用作免疫组化染色。称取皮层、海马重量，按重量的5倍体积加入组织蛋白裂解液，175 000g 4℃离心30min，收取上清液分装，进行生化测定。

1.3.4 乙酰胆碱酯酶活性检测 采用随机数字表法每组选取5只小鼠皮层、海马组织裂解上清液，使用乙酰胆碱酯酶活性测定试剂盒检测小鼠脑组织乙酰胆碱脂酶活性，所有操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 Aβ42含量测定 使用1.3.4中选取的组织裂解上清液，采用ELISA法测定小鼠皮层和海马Aβ42含量，所有操作步骤严格按照Aβ42ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.6 金属离子测定 使用1.3.4中选取的组织裂解上清液，参照全血、血清多元素检测试剂盒说明书测定小鼠脑组织内的锌离子、镁离子、钙离子、铜离子含量。

1.3.7 免疫荧光法测定脑内Aβ42淀粉样斑块沉积 将冰冻切片于PBS中室温平衡15min，然后置于2mol/L盐酸溶液中，37℃恒温摇床孵育30min，再于0.1mol/L硼酸溶液中孵育2次，每次5min，TBS漂洗；用10%封闭驴血清孵育60min，加入一抗，4℃孵育过夜，然后吸出一抗，TBS漂洗；加荧光标记的二抗，37℃恒温摇床上孵育1h，TBS漂洗，将切片贴在载玻片上，盖上盖玻片封好。野生型小鼠对照组大脑皮层和海马组织中几乎检测不到Aβ42，而转基因小鼠对照组和转基因小鼠多奈哌齐各剂量组大脑皮层和海马组织中Aβ42含量均明显高于野生型小鼠对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。转基因小鼠多奈哌齐各剂量组和转基因小鼠对照组大脑皮层和海马组织中Aβ42含量比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。

表1 各组小鼠大脑皮层和海马中组织乙酰胆碱酯酶活性比较（U/mgprot）

表2 各组小鼠大脑皮层和海马组织中Aβ42含量比较（10-6mg/ml）

2.3 各组小鼠大脑皮层和海马组织中金属离子含量比较转基因小鼠对照组和转基因小鼠多奈哌齐各剂量组大脑皮层和海马组织中镁离子、钙离子和铜离子含量均高于野生型小鼠对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。转基因小鼠多奈哌齐各剂量组和转基因小鼠对照组大脑皮层和海马组织中镁离子、钙离子和铜离子含量比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。各组小鼠大脑皮层和海马组织中锌离子比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。

2.4 Aβ42淀粉样斑块沉积的免疫荧光测定 12月龄APP/PS1-AD转基因小鼠大脑皮层和海马等区域均出现明显的Aβ42淀粉样斑块沉积，但多奈哌齐长期给药未显著减少Aβ42淀粉样斑块沉积，见图1（插页）。

图1 多奈哌齐对APP/PS1-AD转基因小鼠脑内Aβ42淀粉样斑块肽沉积的影响-免疫荧光图（a:野生型小鼠对照组；b：转基因小鼠对照组；c：转基因小鼠多奈哌齐3mg/kg组；d:转基因小鼠多奈哌齐6mg/kg组）

3 讨论

AD是发生在中枢神经的一种病因复杂的原发性神经退行性疾病。由于AD的发病是多因素交叉引起的，其病理及生化的改变是多方面的，众多的学者在研究过程中，形成了各自不同的假说，其中Aβ淀粉样肽学说是目前大家对AD比较公认的发病机制[6]。近年来的在体内和体外实验发现，淀粉样前体蛋白（APP）和其代谢的蛋白片段Aβ的形成与金属离子的代谢紊乱有关[7-8]。锌和铜参与了AD患者脑组织正常细胞蛋白的聚集和活性氧簇的产生，另外金属离子还参与了AD的其他相关病理过程，如神经元纤维缠结的形成、分泌酶清除APP过程和蛋白水解酶降解Aβ。

APP/PS1-AD转基因小鼠是一种经典的、国内外较公认的AD转基因动物模型之一，此模型可稳定表达突变的人类早老素1和APP融合体，引起细胞外淀粉样蛋白的沉积[8]，其优势是将两个易感基因结合在一起，从而缩短病理变化时间，并使病理特征多样化，能够较好地模拟AD患者的早期病理和行为特征[9]以及模拟AD患者胆碱能系统的改变。研究证明，AD患者大脑内存在胆碱能系统的紊乱[10]。胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐是临床常用的抗AD药物，本研究以多奈哌齐为受试药，考查了多奈哌齐抗AD的作用。在前期的行为学实验中，实验结果显示APP/PS1-AD转基因小鼠存在明显的学习记忆能力缺失现象，但多奈哌齐对APP/PS1-AD转基因小鼠的学习记忆障碍无明显改善作用，提示在此动物模型中多奈哌齐治疗AD的作用没有达到预期效果，因此本实验旨在揭示多奈哌齐未能改善APP/PS1-AD转基因小鼠的学习记忆障碍功能的机制。本实验结果显示多奈哌齐可明显降低APP/PS1-AD转基因小鼠大脑皮层组织中乙酰胆碱酯酶活性，但多奈哌齐对小鼠海马组织中乙酰胆碱酯酶活性却并无影响；Aβ42含量检测结果显示野生型小鼠脑内几乎检测不到Aβ42，转基因小鼠对照组皮层和海马组织中Aβ42含量明显升高，但多奈哌齐长期给药未能减少Aβ42淀粉样斑块沉积；金属离子测定结果显示，多奈哌齐长期给药对转基因小鼠大脑皮层组织镁离子、铜离子和钙离子含量无明显影响。

表3 各组小鼠大脑皮层和海马组织中金属离子含量比较

多奈哌齐是目前临床上使用最广泛的胆碱酯酶抑制剂之一，其主要作用通过增加脑内乙酰胆碱水平而发挥学习记忆改善作用。在东莨菪碱诱导的小鼠痴呆模型上，多奈哌齐显示了良好的学习记忆改善作用。但APP/PS1-AD转基因小鼠的学习记忆缺失主要是由Aβ的毒性引起，多奈哌齐可能并不能通过此环节发挥作用。本研究提示AD发病机制的复杂性，其病理及生化的改变也是多方面的，因此不同的动物模型只能反映AD病理变化的某一方面，而对于AD治疗药物特别是新药的药效评价应采用多种动物模型综合评价。