NGF和PTEN双基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化效果观察

林平 陈毅 梁淑霞 李焘 邵依娜 赵有顺 吴咏军 涂迎春 黄志丹 安涛

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSC）能够高度增殖分化，并且通过诱导向脂肪、骨、肌肉及神经等多种组织细胞进行分化[1-3]。既往研究已证实MSC通过基因修饰或适当的诱导剂后，具有在特定基因表达和功能特性的神经元细胞中分化的潜力[4-7]。此外，植入MSC对微环境信号有反应并分化为神经元样细胞，这些神经元样细胞可诱导动物坐骨神经再生[8-9]。MSC还具有分泌神经营养因子的能力，有助于修复受损神经元[10]。因此，MSC作为理想的种子细胞，为外周神经细胞损伤的临床治疗提供了机会。然而，有研究表明MSC的神经源性分化能力有限，移植入动物体内后再生能力不足限制了MSC作为种子细胞在研究中的应用。巢蛋白-1（Nestin-1）为神经元的特征性标志物。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经营养蛋白的成员，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要作用和临床意义。10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源物丢失（phosphatase and tensin homologs deleted on chromosome 10，PTEN）已被证实在哺乳动物的中枢神经系统中广泛表达，并且优先在神经元中表达[11]。PTEN基因的缺失或抑制能够促进轴突再生[12]。但迄今未见NGF过表达与PTEN瞬时下调相结合提升MSC向神经元样细胞分化，从而影响对周围神经再生能力的相关研究。为进一步证实NGF与PTEN双基因修饰对MSC向神经元样细胞分化的影响，从而影响对周围神经再生能力，笔者拟通过增强NGF过表达和PTEN瞬时下调对MSC进行双基因修饰，观察双基因修饰后的MSC向Nestin-1阳性细胞（神经元样细胞）分化的能力，为其提升周围神经再生能力提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 具有绿色荧光蛋白（GFP）标记的 Ori－CellTMSD 大鼠 MSC（MSC/GFP）（Cat.No.RASMX-01101）购自美国Cyagen Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠MSC的培养 复苏SD大鼠来源的MSC/GFP，将其接种到含有OriCellTMMSC生长培养基的25cm2培养瓶中，放在37℃，5%CO2培养箱内培养。每3d更换1次生长培养基。细胞长满至80%～90%时，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%的EDTA）进行消化，离心收集细胞后传代，收集第3代细胞用于后续实验。用荧光显微镜观察细胞表达绿色荧光情况。

1.2.2 大鼠MSC/GFP表面标志物检测 采用流式细胞术。将第3代大鼠MSC/GFP使用胰蛋白酶消化后调整细胞悬液浓度，以每管1×106个/ml的细胞与细胞表面标志物CD29、CD34、CD44、CD45的一抗（美国eBioscience公司）混合，然后再与异硫氰酸荧光素（FITC，美国BD公司）偶联的二抗混合，4℃避光孵育30min后，使用流式细胞仪进行检测。

1.2.3 MSC/GFP的成骨和脂肪形成分化能力检测 将大鼠MSC/GFP用胰蛋白酶消化并接种于成骨分化培养基（含10%胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸盐的DMEM培养基）和脂肪形成分化培养基（含10%胎牛血清、10mg/L胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、0.2mmol/L罗格列酮的 DMEM 培养基），37℃，5%CO2培养箱培养。每3d更换1次分化培养基，在诱导后第19天，使用茜素红S染色和油红O染色鉴定成骨分化和脂肪形成分化。

1.2.4 重组质粒pEF1ANeo01-NGF的构建及转染 设计特异性引物（NGF-Xbal-F：3′-CTAGTCTAGAGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC-5′，NGF-BamHIR：3′-TCAGGATCCGCCTCTTCTTGCAGCCTTCCTG-5′），使用Takara PrimerSTAR Max DNA聚合酶从大鼠cDNA中PCR扩增含有XbaI和BamHI核酸内切酶位点的NGF序列。构建重组质粒pEF1ANeo01-NGF，测序分析重组质粒pEF1ANeo01-NGF。使用LipoHigh将重组质粒pEF1ANeo01-NGF转染到大鼠MSC/GFP中，转染后 24h，加入最佳筛选浓度（500μg/ml）的遗传霉素（G418），每隔2d更换新的含有最佳筛选浓度G418的培养液，连续培养4周。收集抗性细胞，获得稳定转染细胞株，命名为大鼠NGFhighMSC/GFP。

1.2.5 小干扰RNA（siRNA）干扰瞬时下调大鼠NGFhighMSC/GFP中PTEN的表达 设计PTEN siRNA干扰序列：有义：5′-GAGGCGCUAUGUAUAUUAUdTdT-3′，反义：5′-AUAAUAUACAUAGCGCCUCdTdG-3′。取对数生长期的第3代细胞接种于24孔板，至细胞达到80%～90%汇合。siRNA转染培养细胞，5h后更换含有10%胎牛血清且不含抗生素的DMEM，培养48h。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别测定PTEN mRNA和蛋白相对表达量。siRNA转染后的细胞命名为NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP。

1.2.6 实验分组 实验组为双基因修饰的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP，对照组为未经基因修饰的大鼠MSC/GFP。

1.2.7 NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA相对表达量检测 使用Trizol试剂从各组细胞中提取总RNA，吸光度（OD）260/OD280在1.8～2.0内提示样品RNA满足实验要求。根据说明书，使用BioRT cDNA Strand Synthesis Kit逆转录第一链cDNA。将RNA反转录成cDNA。使用2×Taq PCR Master Mix进行，进行qRT-PCR分析。用于扩增NGF、PTEN、Nestin-1和内参GAPDH的特异性引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.8 NGF、PTEN和Nestin-1蛋白相对表达量检测 裂解提取各组细胞总蛋白，BCA测定蛋白浓度。调整蛋白浓度，等量总蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭 1h，分别加入 NGF、PTEN和 Nestin-1一抗（英国Abcam公司），4℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液，室温孵育1～2h。TBST漂洗，然后使用蛋白质印迹ECL荧光检测试剂进行观察。

1.2.9 NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP的细胞活力测定采用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8）。将两组细胞以2 000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养。分别于24、48和72h进行取样检测，加入10μl CCK-8后，将细胞在37℃下培养4h，用微量滴定板读数仪分析450nm处的光密度。进行了5次独立实验。

1.2.10 氧-葡萄糖剥夺实验 通过检测氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡，分析双基因遗传诱导对大鼠MSC/GFP存活的影响。将两组细胞接种于无血清和无葡萄糖的人工脑脊液（ACSF）（pH 7.4），其中含有 125mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，25.7mmol/L碳酸氢钠，2mmol/L硫酸镁，1.2mmol/L磷酸二氢钠和10mmol/L蔗糖。细胞在 37℃，90%N2，9%CO2和 1%O2环境下孵育。4h 后，用生长培养基替换ACSF，将细胞在正常氧条件下37℃培养2h，收集细胞悬液。根据Annexin V凋亡试剂盒的说明，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P≤0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 大鼠MSC/GFP绿色荧光和表面标志物表达情况检测 双基因未修饰前，对OriCellTM大鼠MSC/GFP的绿色荧光表达情况进行观察，发现次代培养时，显示出强烈的绿色荧光。约90%的第3代细胞仍可见荧光信号，见图1（插页）。使用表面标志物CD29、CD34、CD44、CD45抗体对第3代大鼠MSC/GFP进行流式细胞术分析，通过明确确定的细胞表面抗原表达来分析大鼠MSC/GFP的规格和纯度。结果显示（99.29±3.12）%的细胞 CD44阳性，（96.41±2.33）%的细胞 CD29 阳性，（8.91±0.66）%的细胞 CD34阳性，（6.79±1.01）%的细胞CD45阳性，见图2（插页）。

2.2 大鼠MSC/GFP的成骨和脂肪形成分化能力检测将大鼠MSC/GFP在成骨分化培养基中培养19d后（图3a，插页），在显微镜下观察到红色矿化结节（图3b，插页）。此外，脂肪形成分化培养基中生长的大鼠MSC/GFP不断扩大，可见细胞内脂滴（图3c，插页）。显微镜下见油红O染色呈阳性反应（图3d，插页）。

2.3 构建重组质粒pEF1ANeo01-NGF 凝胶电泳显示在成功从大鼠cDNA PCR扩增产生约0.72kb的目的片段NGF（图4a）。XbaI和BamHI酶切鉴定重组质粒，显示出5.4和0.72kb两个片段（图4b）。对重组质粒pEF1ANeo01-NGF进行测序，单点突变发生在186（TC）（图4c），在大鼠NGF的氨基酸序列中未发现突变（图4d）。因此，上述数据表明成功构建了携带大鼠NGF片段的重组质粒。

2.4 两组细胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA和蛋白相对表达量比较 实验组大鼠MSC/GFP中NGF和Nestin-1 mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组，而PTEN mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

2.5 双基因修饰调控对大鼠MSC/GFP细胞活力的影响 CCK-8实验表明，实验组大鼠MSC/GFP在48、72h时间点的OD值均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结果表明双基因修饰可以促进大鼠MSC/GFP的增殖（图6）。

2.6 双基因修饰调控对大鼠MSC/GFP氧-葡萄糖剥夺诱导的增殖和凋亡的影响 对照组和实验组在正常缺氧条件下存活率相当，细胞存活率分别为93.92%和95.21%。氧-葡萄糖剥夺处理后，实验组存活率为65.03%，明显高于对照组的51.77%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图7）。表明双基因修饰可以促进大鼠MSC/GFP的存活。

图4 重组载体pEF1ANeo01-NGF的鉴定（a：扩增产生约0.72kb的 DNA 片段，M：DL 2000 DNA 标记，1～5：阳性克隆；b：重组载体pEF1ANeo01-NGF用内切核酸酶XbaI和BamHI消化，显示出5.4和 0.72kb 片段，M：1kb DNA Ladder，1～2：通过双核酸内切酶消化的产物；c：DNA测序显示186（T-C）处的单突变；d：编码的氨基酸序列与大鼠NGF精确匹配）

3 讨论

MSC是指骨髓基质内非造血干细胞来源的细胞亚群，具有自我更新、多向分化潜能、对机体损伤小、易得性强、高增殖特性、易于基因操作等优点，成为再生医学领域研究应用最为广泛的成体干细胞[13]。MSC可能作用机制包括：MSC向损伤组织迁移和抑制宿主免疫反应的能力；MSC的去分化和再分化；MSC直接分化为上皮细胞或消化道干细胞；MSC与消化道干细胞或成熟上皮细胞融合；MSC参与损伤微环境的重建[14]。此外，MSC虽表现出了神经再生的能力，但其有效性仍有待提高。

本研究在培养过程中对MSC/GFP的荧光信号持续进行检测，并对OriCellTMSD大鼠MSC/GFP的质量进行评价。通过检测 MSC/GFP中 CD29、CD44、CD34、CD45 等多种抗原标志物的表达，发现大多数MSC/GFP CD29和CD44表达呈阳性，但只有少数细胞CD34和CD45表达呈阳性，大鼠MSC/GFP特异性抗原标志物的表达模式与MSC的既定表型是一致的[15]，由此鉴定了MSC/GFP的纯度。本研究还发现大鼠MSC/GFP能够在成骨和成脂分化培养基中生长，并对茜素红S和油红O呈阳性染色，表明大鼠MSC/GFP具有多能分化能力。因此，笔者认为OriCellTM大鼠MSC/GFP具有高效的特异性和多潜能，可为将来进一步实验研究提供理论基础。

图5 两组细胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA和蛋白相对表达量比较（a：两组细胞NGF、PTEN和Nestin-1 mRNA相对表达量比较；b：两组细胞NGF、PTEN和Nestin-1蛋白相对表达的电泳图；c：两组细胞NGF蛋白相对表达量比较；d：两组细胞PTEN蛋白相对表达量比较；e：两组细胞Nestin-1蛋白相对表达量比较）

图6 CCK-8测定细胞增殖

图7 由大鼠MSC/GFP和NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP的氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡（a：在生长培养基和常规条件下培养的大鼠MSC/GFP；b：在生长培养基和常规条件下培养的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP；c：用氧-葡萄糖剥夺处理的大鼠MSC/GFP；d：用氧-葡萄糖剥夺处理的NGFhigh/PTENlow大鼠MSC/GFP）

NGF具有增强周围神经损伤愈合的能力，并且通过产生神经肽信号和受体促进MSC向神经元样细胞分化[16-17]。而PTEN是一种细胞内固有表达的非分泌型蛋白，能够通过PTEN/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导通路完成细胞突起的生长，其表达受抑制有利于损伤的周围神经的再生。因此，本研究初步探索了大鼠MSC/GFP中NGF和PTEN的固有表达，结果显示大鼠MSC/GFP呈现NGF低表达以及PTEN高表达，该结果与之前的研究一致：在SD大鼠MSC中几乎没有检测到NGF的表达[18]，而PTEN在人MSC中有表达[19]。多项研究表明，PTEN能够下调磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/mTOR促存活信号[20-21]，而PI3K/Akt信号通路的激活被证明是NGF促进MSC增殖的关键[22]。此外，Akt在介导NGF在MSC向神经元分化和抗神经元凋亡中具有一定的作用[23-24]。目前，Zhang等[25]发现MSC在NGF培养基中能够发挥神经保护作用，其原因在于MSC能够触发NGF-PI3K/Akt/mTOR信号通路。因此，大鼠MSC/GFP固有的较强PTEN可以通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路和抑制NGF的作用来减弱受损外周神经的再生。

为了增强大鼠MSC/GFP修复受损外周神经的作用，本研究通过转染含有大鼠NGF片段的重组质粒对NGF进行过表达，同时采用特异性小RNA干扰瞬时下调PTEN，但PTEN并没有永久性的敲除。PTEN作为一个主要的肿瘤抑制因子，在中枢神经系统、心、肝、肾、胃肠道及皮肤等全身多器官均有表达，既往研究也显示PTEN的药理学抑制可能是一种抗癌治疗方法[13，26]。笔者发现siRNA干扰可瞬时下调MSC/GFP中PTEN的表达，而转染重组质粒pEF1ANeo01-NGF可使NGF的表达上调。此外，本研究还揭示了双基因修饰对大鼠MSC增殖的积极作用。为了评估双基因修饰对生物学行为的影响，还检测了氧-葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡。结果显示，双基因修饰促进细胞存活，有利于再生的应用。上述信号传导途径也能够调控双基因修饰对在氧-葡萄糖剥夺条件下培养的MSC的增殖和存活。

为了探索双基因修饰能否增强大鼠MSC的神经元分化，本研究对是否进行双基因修饰细胞中的神经元分化标志物Nestin-1表达进行了评估，结果发现大鼠MSC/GFP的Nestin-1表达较弱，这与之前的报道一致[27-28]，但双基因修饰在mRNA和蛋白水平上Nestin-1表达却显著上调。上述发现表明大鼠NGFhigh/PTENlowMSC/GFP更倾向于神经元细胞分化，其原因可能为高表达的NGF抑制了PTEN介导的信号通路。

综上所述，大鼠骨髓来源的MSC/GFP在机体固有地低表达NGF并高表达PTEN。通过NGF的过表达和PTEN的瞬时下调进行双基因修饰能够使大鼠骨髓来源的MSC获得较强的分化为Nestin-1阳性细胞（神经元样细胞）的能力，由此表明双基因的修饰增强了MSC的神经再生能力，但具体的调控机制有待于进一步研究探讨。