MTHFR基因多态性与HPV感染的宫颈鳞状细胞癌发病关系的研究

蒋卫平 蒋慧玲 史杨 程慧斐 张嵩韬 黄桂英 裴立红 徐燕 赵志钢 周丽红

宫颈鳞状细胞癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈鳞状细胞癌发生的主要原因，同时宿主因素也起着重要作用，即不同的群体和个体对宫颈鳞状细胞癌的易感性存在差异。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetraahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢的关键限速酶，参与DNA的甲基化过程，大量研究表明，MTHFR基因多态性与宫颈鳞状细胞癌的发生、发展及预后关系密切。以往对浙江省丽水地区妇女HPV感染的流行病学调查显示，患者最常见的高危型HPV为16、18、52和58型[1]。为此，笔者在丽水地区进行MTHFR基因多态性与HPV（16、18、52、58）感染者宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系研究，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年5月至2018年10月在丽水市中心医院住院治疗的高危型 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌患者115例为病例组，均经组织病理学检查证实为宫颈鳞状细胞癌，经HPV分型检测为HPV 16、18、52、58型这 4个型别的单一或混合感染。另择同期来丽水市中心医院体检的143例妇女为对照组，均未感染 HPV。病例组年龄 31～70（52.8±9.2）岁，对照组年龄 30～69（53.1±8.9）岁，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试者均为丽水市籍并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有受试者均采集宫颈分泌物和静脉血。宫颈分泌物用专用细胞保存液保存，静脉血用EDTA-K2抗凝。所有标本采集当天完成所有项目检测。

1.2.2 HPV分型检测 采用广州安必平医药科技股份有限公司产品，该试剂运用PCR-反向点杂交法，具体为针对HPV基因组晚期区L1区设计特异性引物和28型探针，并将特异性探针包被在尼龙膜上，再通过生物素标记的引物进行靶片断扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，通过杂交、洗膜，靶标中的型特异性片断会和特异性探针结合，最后进行显色和结果分析，从而检测HPV 28种基因型DNA，包括15种高危型别：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82（MM4）；3 种疑似高危型别：26，53，66；10 种低危型别：6，11，40，42，43，44，54，61，81（cp8304），83（MM7）。

1.2.3 MTHFR基因多态性检测

1.2.3.1 核酸提取或纯化 采用江苏康为世纪生物科技有限公司产品，该试剂运用柱式提取法，具体为样本经蛋白酶K结合、裂解后，DNA特异性结合到Spin Columns柱上，污染物经离心丢弃，PCR抑制剂可通过两步有效的洗涤被完全去除，结合在离心柱上的核酸可用洗脱液洗脱，得到纯化的DNA，基因组DNA要求：经紫外分光光度计检测吸光度（OD）值，OD260/OD280≥1.7，OD260/OD230≥1.5，纯度 5～10ng/μl。

1.2.3.2 MTHRF多态性检测 采用江西诺德医疗器械有限公司产品，该试剂运用实时荧光PCR技术进行检测，针对MTHFR C677T、A1298C两个位点设计引物和探针，在677-T和1298-A的探针上标记FAM荧光素，在677-C和1298-C的探针上标记VIC荧光素，通过实时荧光PCR分析其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

1.3 观察指标 （1）MTHRF基因SNP位点信息。通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1801133网站查询。（2）病例组患者HPV分型分布情况。（3）两组受试者MTHFR-C677T、MTHFR-C677T基因型和等位基因分布频率。（4）分析MTHFR基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系。用比值比（OR值）来表示暴露因素与疾病间的关联强度。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。采用Haploview4.2软件进行Hardy-Weinberg平衡检验。以非条件logistic回归分析计算表示相对风险度的OR值及其95%CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHRF基因SNP位点信息 通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1801133网站查询到：MTHFR中的rs1801133基因多态性位点，MTHFR中的677C＞T表示在第677个碱基位置中编码丙氨酸（Ala）的密码子GCC中的第2个碱基C突变成T形成编码缬氨酸（Val）的密码子GTC，编码的氨基酸位置为第222个，表示为Ala222Val。同理，查询到：MTHFR中的rs1801131基因多态性位点，1298A＞C表示第1 298个碱基位置中编码谷氨酸（Glu）的密码子GAA中的第2个碱基A突变成C形成编码丙氨酸（Ala）的密码子GCA，编码的氨基酸位置为第429个，表示为Glu429Ala。

2.2 病例组患者HPV分型分布情况 病例组患者感染 HPV（16）70 例，占 60.8%；感染 HPV（18）11 例，占9.6%；感染 HPV（52）14例，占 12.2%；感染 HPV（58）20例，占17.4%。其中31例患者同时感染其他型别的HPV（至少包括16，18，52，58中的1种），占26.9%。

2.3 两组受试者MTHFR-C677T、MTHFR-C677T基因型的Hardy-Weinberg平衡检验和比较 病例组和对照组MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05）。病例组和对照组MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C基因型频率分布比较均有统计学差异（均P＜0.05），见表1～2。

2.4 MTHFR基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系分析 非条件logistic回归分析显示，MTHFR基因C677T多态性位点中，携带T的受试者HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是携带C的受试者的 1.871 倍（OR=1.871，95%CI：1.294～2.705，P＜0.05）；MTHFR基因A1298C多态性位点中，携带C的受试者HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是携带A 的受试者的 1.867 倍（OR=1.867，95%CI：1.204～2.896，P＜0.05），见表 3。

3 讨论

MTHFR将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-四氢叶酸，5-四氢叶酸作为辅因子在经蛋氨酸合成酶的催化作用后生成蛋氨酸，蛋氨酸在腺苷转移酶的作用下生成S-腺苷甲硫氨酸；MTHFR基因多态性是导致酶活性降低或缺失以及热稳定性改变的主要机制[2]。MTHFR基因位于1号染色体短臂上(1p36.3)，共有11个外显子和10个内含子；目前发现的MTHFR突变位点有近20多个，其中与人类疾病关系较为密切的是C677T和Al298C[3]。

本研究以丽水地区人群为研究对象，探讨了MTHFR-C677T和MTHFR-A1298C基因多态性与HPV（16、18、52、58）感染的宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系，统计学分析表明两组样本两个基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象具有群体代表性，分别代表了丽水地区HPV阴性的健康妇女和感染HPV（16、18、52、58）的宫颈鳞状细胞癌患者。通过统计分析发现，MTHFR-C677T多态性位点中，携带T的受试者HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是携带C的受试者的1.871倍；MTHFR-A1298C多态性位点中，携带 C 的受试者 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌发病风险是携带A的受试者的1.867倍。

表1 MTHFR-C677T基因型的Hardy-Weinberg平衡检验和比较[例（%）]

表2 MTHFR-A1298C基因型的Hardy-Weinberg平衡检验和比较[例（%）]

表3 MTHFR基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系分析

Zhu等[4]综合了13项（共计1 936例患者和2 858例对照）MTHFR基因多态性和宫颈癌相关研究，认为MTHFR 677T等位基因可能增加亚洲女性人群患宫颈癌的风险，并对白人女性起到保护作用，此结论支持本研究结果，而MTHFR-A1298C基因多态性与宫颈癌的发生关联有限；结果提示MTHFR基因多态性与宫颈癌的相关性存在种族特异性分布差异。Botezatu等[5]研究发现MTHFR 677T等位基因使罗马尼亚妇女罹患宫颈癌的风险增加3倍，也跟本研究结论相仿。González-Herrera等[6]研究认为MTHFR-C677T多态性与墨西哥妇女发生浸润性宫颈癌风险缺乏相关性，MTHFRA1298C多态性中，杂合子AC基因型和C等位基因与降低患病风险相关，而纯合子AA基因型和A等位基因与浸润性宫颈癌的患病风险升高相关，这一结论跟本研究截然相反。Hajiesmaeil等[7]认为MTHFR 677CC和1298CC与宫颈癌的发病风险密切相关，前者跟本研究结论相反而后者跟本研究结论一致。张小莉等[8]对兰州100例宫颈鳞状细胞癌和100例健康对照研究显示，MTHFR基因C677T位点多态性使宫颈鳞癌发生的风险增加了1．883倍，MTHFR C677是宫颈鳞癌发生的危险因素，677T对个体罹患宫颈鳞癌的风险无显著差异，与本研究结论相反。范岩峰等[9]对厦门市129例病例和214例健康对照研究显示，宫颈癌的发病可能与体内叶酸水平偏低及生育年龄过早有关，在MTHFR 1298基因多态性中，携带AC或CC基因型可能是宫颈癌发病的易感基因，尤其是CC基因型，与本研究的结论一致。

综上所述，MTHFR基因多态性与宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系尚无定论，并且存在较大的种族和地域分布差异。由于地理环境和生活条件的不同，相同的基因突变在不同的人群中所发挥的作用不同。对于浙江省丽水地区妇女而言，MTHFR 677T和1298C基因型可能是感染 HPV（16、18、52、58）的宫颈鳞状细胞癌的高危因素。本文研究的是MTHFR（C677T和A1298C）基因多态性与 HPV（16、18、52、58）感染的宫颈鳞状细胞癌发病风险的关系，病例组是高危型 HPV（16、18、52、58）感染宫颈鳞状细胞癌患者，对照组是高危型HPV感染阴性的健康妇女。研究表明，绝大部分妇女感染HPV是一过性，只有持续高危型HPV感染才可能最终导致宫颈鳞状细胞癌。基于此，如果要研究MTHFR基因多态性对高危型HPV感染者患宫颈鳞状细胞癌的风险，则对照组应该是高危型HPV感染而宫颈鳞状细胞无改变的健康人群，这也提示笔者可以从这个角度作进一步的研究分析。