聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子工作对照品的制备和标定

张培彪，柳常青，刘 忠，张贵民

（山东新时代药业有限公司 山东省蛋白类药物工程实验室，山东 临沂 273400）

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）的主要作用是刺激中性粒细胞系（lineage）造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能。聚乙二醇化rhG-CSF（PEG-rhG-CSF）实现了长效增加外周血中性粒细胞数量的目的。PEG为高度水合的聚合物，每个甲氧基单元可结合1～2个水分子，力学半径较大，可将被修饰蛋白的分子量提高约5～10倍。PEG修饰的蛋白质和多肽类药物在血液循环中的半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，药物的毒副作用减少，明确改善rhG-CSF在临床应用中的局限性[1-2]。

蛋白质含量测定是生物制品质量控制的重要指标之一，准确的蛋白质含量测定结果不仅对相应产品的分装量有重要意义，且对比活性计算、残留杂质的限量控制及其他理化特性测定也有重要意义[3]。

目前国内仅有rhG-CSF国家标准品，暂无PEG-rhG-CSF同质标准品。即使未来PEG-rhG-CSF标准品上市销售，往往因数量和成本的限制，企业很难有足够数量的标准品用于检验。因此监管机构和检验机构鼓励企业通过自制的方式，获得足够数量的对照品，并用国家标准品进行标定。本文用自制的高纯度原液，制备了PEG-rhG-CSF工作对照品，进行全面检定和结构确证，并对其进行协同标定，标定结果符合统计学要求，制备和标定过程对于企业进行自制对照品具有一定的指导意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

Cogent M1超滤系统（默克密理博）；灌装泵（Flexicon公司产品）；Telstar 3PS冻干机（西班牙泰仕达）；凯氏定氮仪，多功能酶标仪（BMG公司）；XevoG2-XS QTof高分辨质谱仪（Waters公司）；Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪（Waters公司）；PPSQ-33A/B全自动蛋白质多肽测序仪（Shimadzu公司）；5800 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（AB Sciex公司）。

1.2 材料

PEG-rhG-CSF原液，由山东新时代药业有限公司生产，各项检测指标均符合要求；甘露醇（青岛明月海藻集团有限公司）；枸橼酸和枸橼酸三钠（湖南尔康制药股份有限公司）；聚山梨酯80（南京威尔药业有限公司）。

2 方法

2.1 工作对照品制备

2.1.1 原液换液稀释 将PEG-rhG-CSF原液进行超滤换液，置换液为10 mmol/L枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液，pH 4.0。置换后的原液加入甘露醇80 mg/ml，并用10 mmol/L枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液将PEG-rhG-CSF稀释至1 mg/ml。

2.1.2 对照品分装 将灌装泵标定6次，至灌装精度1 %以内。用Flexicon自动灌装系统将PEG-rhG-CSF分装至2 ml西林瓶中，每瓶装量1 ml。

2.1.3 冻干 每个西林瓶进行半压塞，转移至冻干机冻干，执行表1冻干程序。

表1 冻干程序

冻干结束后充氮，加塞轧盖。将所得样品取样进行检定，检定合格后标定蛋白质含量，即可作为工作对照品使用。

2.2 工作对照品检定

参考《中国药典》2015年版四部通则中的方法进行外观检查、蛋白质含量测定、生物学活性测定、等电点测定、紫外光谱扫描、外源性DNA残留测定、宿主菌蛋白质残留量测定、无菌检查、细菌内毒素检查。

电泳法纯度测定：照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（《中国药典》2015年版四部通则0541第五法），用非还原型电泳法测定，分离胶浓度为15 %。

反相色谱法（RP-HPLC）纯度测定：按《中国药典》2015年版四部通则0512，色谱柱采用丁烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相流速1 ml/min，检测波长214 nm。

分子排阻色谱法纯度测定：采用T S K G3000SWXL凝胶分析柱，流动相流速0.5 ml/min，检测波长214 nm。

PEG残留量测定：采用HPLC串联蒸发光检测器方法，以丁烷基硅烷键合硅胶为填充剂，蒸发光检测器参数：温度113.0 ℃，撞击器关（impactor off），载气流速3.1 L/min。

PEG修饰度测定：采用HPLC，紫外检测器与示差检测器联用。

2.3 工作对照品结构确证

飞行时间质谱精确相对分子质量测定、HPLC质量肽图、N-末端氨基酸序列、二硫键配对分析：委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定工作对照品的精确相对分子质量，在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量，原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出。

H P L C质量肽图：供试品经胰蛋白酶（trypsin）酶解处理后采用超高效液相色谱系统（Acquity UPLC I-Class）分离。脱盐及分离后用XevoG2-XS QTof质谱仪进行质谱检测分析，原始数据使用UNIFI（1.8.2，Waters）软件查库比对后得到结果。

N-末端氨基酸序列：样品用Edman降解法处理后用全自动蛋白质多肽测序仪（PPSQ-33A）测定。

二硫键配对分析：供试品经酶解处理后经超高效液相系统（Acquity UPLC I-Class）分离。脱盐及分离后用质谱仪（XevoG2-XS QTof）检测。

质谱检测分析：用UNIFI（1.8.2，Watersr）软件查库，结合软件和附加的人工解析，获得了二硫键配对信息。

2.4 凯氏定氮标定

按2015年版《中国药典》四部进行。选取3个不同实验室，每个实验室抽取12支样品，用凯氏定氮法标定蛋白质含量，分析36次测定结果，计算平均值、标准差、方差、95 %置信区间。

3 结果

3.1 工作对照品常规检测结果

工作对照品检验结果见表2、表3。该批工作对照品的装量差异为0.3 %，残留水分为0.6 %，满足2015年版《中国药典》规定的国家标准品要求（装量差异±1 %以内、残留水分不高于3.0 %）。其余外观、可见异物、溶解度、无菌检查均符合现行版药典要求。

该批对照品的电泳法纯度、反相HPLC纯度、分子排阻色谱法纯度等主要纯度指标均大于99.5 %，见图1、图2。其余蛋白含量、等电点、比活性、PEG残留、修饰度等指标均符合相关技术指导原则要求[4-6]。

表2 工作对照品检定结果

表3 工作对照品检定结果

图1 PEG-rhG-CSF工作对照品分子排阻色潽法图谱

图2 PEG-rhG-CSF工作对照品反相色潽法图谱

3.2 工作对照品结构鉴定结果

工作对照品结构鉴定结果见表4。该批工作对照品的精确相对分子质量（见图3）、质量肽图、N-端氨基酸序列、二硫键分析、游离巯基、PEG位点确证等均与理论符合。

表4 工作对照品结构确证结果

图3 MALDI-TOF-MS测定PEG-rhG-CSF工作对照品相对分子质量

3.3 工作对照品标定结果

该批工作对照品的凯氏定氮标定结果见表5。3个实验室标定的均值为1.9595，1.9264，1.9158 mg/支，与Lowry法检验结果基本一致（1.95 mg/支），统计学分析差异无统计学意义。

共计36次标定结果统计表明，该对照品的平均值为1.9339 mg/支，标准差为0.02295 mg/支，RSD=1.19 %，95 %的置信区间：1.9261～1.9417 mg/支。

4 讨论

本文制备的工作对照品选用工艺稳定的商业化产品，选择纯度较高的原液批次，经检验合格后，进行配制、分装、冻干。严格控制配制环境和分装环境的微生物和房间湿度。选用分装精度高的分装设备，控制装量差异。摸索合适的冻干工艺，严格控制工作对照品的残留水分。

按上述要求制备的PEG-rhG-CSF工作对照品，经检测，主要纯度指标、体外生物学活性均优于已上市的PEG-rhG-CSF注射液，其余指标也均符合相应的标准要求[4]。

表5 工作对照品凯氏定氮标定结果

目前该工作对照品的长期稳定性已完成24个月的考察，主要监控项目如活性、纯度及高分子物质含量、PEG残留等无显著变化。又因该工作对照品为冻干粉，储存条件-20 ℃以下，所以理论上本品的储存期大于注射液的储存期（2～8 ℃下2年）。

综上所述，本文制备的工作对照品，各项指标均符合相关要求，可用于PEG-rhG-CSF原液、注射液等鉴定、含量测定及各种理化项目检测。目前国内只有rhG-CSF相关的含量、活性国家标准品，暂无市售的PEG-rhG-CSF国家标准品。本文通过严格的制备、检验、鉴定、标定过程，获得符合相关标准的工作对照品，用于中试研究及生产过程的检验，为企业自制工作对照品提供参考。