分子对接技术结合LC-MS/MS筛选半夏厚朴汤抗PDE4有效成分

刘作龙，咸瑞卿，付 杰，生立嵩

（1. 山东丰金生物医药有限公司 ，山东 烟台 264100；2. 山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250000；3.华熙生物科技股份有限公司，山东 济南 250101；4. 山东省中医药研究院，山东 济南 250014）

半夏厚朴方来源于汉代张仲景《金匮要略》，主要由半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶组成。半夏厚朴汤有行气散结，降逆化痰之功效。主治梅核气，临床常用于治疗癔病、胃神经官能症、慢性咽炎、慢性支气管炎、食道痉挛等属气滞痰阻者。当代研究以治疗梅核气[1]，反流性食管炎[2]，慢性咽喉炎等为主，有临床研究将半夏厚朴汤用于治疗慢性阻塞性肺病（COPD）[3]。近年，较多研究指出半夏厚朴汤可能对抑郁症有效[4-5]。磷酸二酯酶4（PDE4）靶点是抗抑郁治疗的重要靶点[6]，PDE4抑制剂罗氟司特通过抗炎作用治疗COPD[7]，目前也有研究发现该药有较好的抗抑郁作用[8-9]。这与半夏厚朴汤治疗梅核气兼有抗抑郁效果的作用极为相似，提示我们半夏厚朴汤可能存在抗PDE4的成分（组）。因此，本研究选择PDE4靶点蛋白晶体结构，采用国家药学科学数据中心天然小分子药物数据库[10]，中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）[11]，及文献报道的半夏等6味药物中提取的化合物，使用Autodock分子对接软件，筛选对接结果理想的化合物分子。对不同方法提取的半夏厚朴汤样品进行高分辨质谱扫描，对上述对接结果表现较好的化合物进行比对，并比较潜在有效化合物在不同提取方法下的含量差异。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DNA503型电子分析天平（南京伯尼塔电子科技）；KDM型控温电热套（鄄城华鲁电热仪器）；Q Exactive Plus 高效液相色谱-质谱联用仪（美国赛默飞公司）。

1.2 试药

半夏、厚朴、茯苓、生姜、紫苏叶（购自济南建联中药店），乙醇（分析纯，国药集团）；乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.3 软件及数据库

国家药学科学数据中心天然小分子药物数据库，中国知网医药卫生数据库，TCMSP，Autodock1.5.6分子对接软件，Autodock Vina 虚拟筛选软件，Discovery Studio2016版（单机版）。

2 方法与结果

2.1 虚拟筛选

2.1.1 化合物的收集与处理 查询TCMSP[10]，中国知网医药卫生数据库等，收集上述5味中药材公开报道的化合物，共得到1028个小分子化合物，采用Autodock中的raccoon模块处理小分子，优化构象，生成pdbqt文件，作为小分子化合物库。

2.1.2 分子对接与虚拟筛选 利用文献[12]报道的PDE4蛋白晶体结构（PDB ID：3W5E），按文献[13]报道方法，在Autodock1.5.6软件中处理蛋白质晶体结构，去水加氢加电荷后保存为pdbqt文件。利用蛋白质晶体中自带的抑制剂作为结合位置，设置grid box center x=19.999，y=15.795，z=-7.07；grid box size x=24， y=26，z=24。Docking算法采用local search以提高计算速度。将小分子化合物库与PDE4蛋白在Autodock vina中进行分子对接，每味药材所收集的小分子中，取计算结合能最低的2 %作为潜在有效化合物。

2.2 样品提取

按药材粉碎程度和提取溶剂不同设计提取方案，将药材分别粉碎为40目细粉和简单破碎，分别采用95 %乙醇，50 %乙醇及水3种溶剂提取，药材溶剂比为1:10（w:v），回流提取2次，每次2 h。合并提取液，混合均匀后取适量，加甲醇稀释10倍，作为供试品。具体实验设计见表1。

表1 样品提取方法

2.3 超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱仪联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）检测

色谱条件为：色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm）；流动相为0.5 %甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脱，条件见表2，流速0.3 ml/min；质谱条件：扫描范围：80～1200m/z；In-source CID：0.0 ev；分辨率：70 000；AGC Target：1e6；Maximum IT：100 ms； 流速0.3 ml/min；柱温30 ℃；正离子检测，进样量3 µl。

表2 梯度洗脱程序

2.4 分子对接与虚拟筛选结果

对蛋白质晶体中自带的抑制剂分子进行分子对接计算，结合能为-10.9 kcal/mol，说明对接方法可靠，可用于虚拟筛选。经分子对接计算，共筛选得到25个优选化合物，结合能与结构式见表3。结合能最低的化合物前3名用Discovery Studio单机版计算与蛋白质作用力（2D），示意图见图1～3。

表3 优选化合物（结合能最低的前2 %）

半夏 -9.4 b a i c a l a i n半夏 -9.2 c a m p e s t e r o l半夏 -9.2 c o n i f e r i n半夏 -9.1 c y c l o(L-t y r o s y l-L-p h e n y l a l a n y l)生姜 -8.8 g i n g e r e n o n e-C生姜 -8.8 h e p t a p h y l l i n e生姜 -8.7 g i n g e r e n o n e-a生姜 -9.3 m u u r o l e n e生姜 -9.3 α-b u l n e s e n e生姜 -8.9 c l i o n a s t e r o l生姜 -8.9 γ-c a d i n e n e生姜 -8.9 (-)-c a l a m e n e n e茯苓 -8.5 h e d e r a g e n i n

图1 Cavidine与蛋白的作用力模式图

图2 Cosmetin与蛋白的作用力模式图

图3 Isoequilenin与蛋白的作用力模式图

2.5 UPLC-Q-TOF-MS/MS检测结果

对照质谱数据库NIST及文献，本实验共比对5个化合物，分别是黄芩素（baicalein），野黄芩素（scutellarein），四羟基异黄酮（orobol），木犀草素（luteolin），芹菜素（apigenin） ，主要成分UPLC-Q-TOF-MS/MS分析结果见表4。峰面积结果见表5。由表5可见，黄芩素、野黄芩素、木犀草素、四羟基异黄酮4种成分以50 %乙醇提取含量最高，芹菜素以95 %乙醇提取含量最高。粉碎样品成分含量普遍较破碎样品为高，但成分含量主要受提取溶剂影响。

表4 主要成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析结果

表5 主要成分峰面积

3 讨论

筛选半夏厚朴汤方中各药材中25种化合物，结合能大部分低于-9.0 kcal/mol，结合能最低的化合物cavidine（-10.7 kcal/mol）与蛋白质晶体自带抑制剂的结合能（-10.9 kcal/mol）接近，表明这些化合物可能与PDE4酶有较好的结合作用。提示半夏厚朴汤可能通过抑制PDE4作用发挥抗抑郁症作用。

通过LC-MS联用检测，从不同方法提取的半夏厚朴汤中检测到5个潜在有效成分。这5个成分均为黄酮类成分，其他类成分未检出，提示所用的LC-MS检测条件还有待进一步优化。在筛选的有效成分中，部分成分为挥发性成分，因而采用LC-MS未能检测到；也有部分化合物可能在提取过程中损耗，也提示半夏厚朴汤方可能需在特定的提取条件下才能更好地发挥抗PDE4作用。

在不同提取方法下，这5种成分含量差异较大，黄芩素、野黄芩素、木犀草素、四羟基异黄酮4种成分以50 %乙醇提取含量最高，芹菜素以95 %乙醇提取含量最高，成分含量受溶剂的作用影响较大，而药材粉碎程度影响不大。表明不同提取方法可能对半夏厚朴汤治疗抑郁症作用有较大影响。后续还需在综合有效成分含量的基础上，对半夏厚朴汤的提取制剂工艺进行进一步优化验证。