不同产地辣木叶HPLC指纹图谱研究

（广州泽力医药科技有限公司，广东 广州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam.），又称奇树、鼓槌树，是辣木科辣木属（Moringa）的一种木本植物，原产印度及非洲，广泛种植于亚洲和非洲热带和亚热带地区[1-2]。目前我国海南、云南、福建、贵州和广东等地均有种植[3]，2012年被国家卫生部批准为新资源食品。辣木的根、叶和嫩果可食用[4]；种子可榨油[5]。相关研究表明，辣木有降糖降脂[6-8]、通便解酒[9-10]、镇静止痛[11]、抗氧化抗衰老[12-15]等功效，对预防及缓解人体各种慢性病均有一定功效，有必要对其质量标准及化学成分进行深入研究。

目前辣木叶质量标准多以营养成分矿质元素含量高低为指标，忽略了具有药效作用的活性成分变化，仅有金玲等[16]、曾明莹等[17]、许琳等[18]对辣木叶液相指纹图谱进行初步研究。本实验基于高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的优点及辣木叶相关质量研究，收集广东、云南及福建区域的辣木叶，分析比较其HPLC指纹图谱特征，为不同产地辣木叶质量特征的确定、质量控制标准的完善及原料质量可追溯系统的构建提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilengt1100系列高效液相色谱仪（包括DAD阵列检测器，美国Agilent 公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；DV215CD 型电子天平（美国奥豪斯公司）；KQ3200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW135 型中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂

没食子酸对照品（成都普思生物科技有限公司，批号P80380030）；异槲皮苷对照品（北京仪化通标科技有限公司，批号170526-0373）；乙腈，甲醇（美国Fisher 公司，色谱纯），磷酸（成都市科龙化工试剂厂，分析纯），超级纯水。9批辣木叶产地来源见表1。

表1 9批辣木叶原材产地来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长的选择 在紫外检测器下进行全波长扫描，全波长扫描图显示在230 nm下出现的色谱峰较多，且大部分样品的色谱峰有较强的吸收。根据紫外检测结果，选择230，254，280，320，360 nm 5个波长进行HPLC分析，见图1。综合紫外全波长检测结果及HPLC分析结果，选择230 nm作为辣木叶HPLC指纹图谱的检测波长。

图1 5个不同波长的色谱图

2.1.2 流动相的选择 辣木叶药材中物质成分复杂，为提高色谱峰分离度，分别考察流动相系统：乙腈-水（加酸）、甲醇-水（加酸），洗脱梯度设置相同，结果见图2。甲醇-水（加酸）系统所得的谱图信息较丰富，因此选择流动相甲醇-水（加酸）。

图2 流动相系统选择

2.1.3 色谱柱的选择 为优选色谱柱，本实验分别考察迪马Diamonsil C18和岛津Inertsil C18色谱柱。结果见图3，Diamonsil C18色谱柱分析效果更优。

图3 色谱柱的选择

2.1.4 洗脱梯度的选择 为保证谱图各成分分离良好，故对色谱梯度进行优化。谱图比较发现，流动相为甲醇-0.05 %磷酸溶液，梯度洗脱条件见表2，分离效果和色谱峰形较好（见图4中6号色谱图）。

表2 梯度洗脱程序

图4 梯度优化色谱图

2.1.5 色谱条件的确定 根据以上优化结果，确定最佳的色谱条件为：色谱柱：迪马Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A），0.05 %磷酸（B）；梯度洗脱（0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %；65～75 min，50 %～100 % A）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品4.0 mg，异槲皮苷对照品2.3 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶，摇匀，即得质量浓度为0.004 g/L没食子酸对照品溶液和0.230 g/L异槲皮苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取辣木叶样品适量，粉碎，过1.2 mm筛网，称取4.0 g，精密称定，置入50 ml具塞锥形瓶，精密加入纯水20 ml，称定质量，超声提取30 min（功率500 W，频率53 kHz），补足减失的质量，过滤（中性滤纸），摇匀，滤液于0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱的方法学考察

2.3.1 精密度试验 依法制备供试品溶液，按2.1.5项下色谱条件，连续进样6次，测定，以没食子酸峰（4号峰）为参照峰，分别测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0 %，相对峰面积的RSD均小于1.5 %，且各谱图相似度均在0.99以上，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 称取同一辣木叶药材细碎品（批号为YF20190401）6份，依法制备供试液，按2.1.5项下色谱条件进样分析，以没食子酸峰（4号峰）为参照峰，分别测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2.0 %，相对峰面积的RSD均小于2.5 %，且各谱图相似度均在0.98以上，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 依法制备供试品溶液，按2.1.5项下色谱条件，分别于0，2，4，6，12，24 h时进样测定，以没食子酸峰（4号峰）为参照峰，分别测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均＜2.0 %，相对峰面积的RSD均＜2.0 %，且各谱图相似度均在0.97以上，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 辣木叶指纹图谱的建立及共有峰的指认

取9批不同产地的辣木叶细碎品适量，按2.2.2项下制备各供试品溶液，按2.1.5项下色谱条件进样分析，记录各产地辣木叶230 nm处的色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）软件生成对照指纹图谱色谱图，标定共有峰15个，见图5，6。精密吸取对照品进行测定，通过与对照品保留时间比对，指认指纹图谱15个共有峰中的没食子酸（4号峰），异槲皮苷（11号峰）。

图5 9批辣木叶药材的指纹图谱叠加图

图6 辣木叶药材指纹图谱共有峰及特征峰标定

2.5 9批辣木叶原材相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对药材样品指纹图谱进行相似度评价，将9批样品色谱图与对照指纹图谱比较，其中没食子酸峰（4号峰）峰形和分离度都较好，故选择作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，具体结果见表3～5。

结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于2.0 %，各共有峰的相对峰面积差别显著，表明不同产地辣木叶药材化学成分在种类无太大差别，但含量存在较大差异。表5结果表明，广东、云南、福建所采集的辣木叶原材相似度在0.6～0.9，化学成分含量呈区域性显著差别，结果与表4结果一致。不同区域辣木叶原材化学成分含量差异较大，原因可能与辣木叶原材中成分含量受地区气候、采收期及加工方式等因素有关。

3 讨论

本研究首次对广东地区、云南地区、福建地区采集的辣木叶药材液相指纹图谱研究，经方法学考察，精密度、稳定性、重复性、准确度良好，多批辣木叶的成分种类差别小，但各共有峰峰面积相差较大，表明本实验收集的不同区域辣木叶成分含量有较大差异，且同一区域的辣木叶成分种类基本吻合。本实验建立的液相指纹图谱质量标准可准确反映不同区域辣木叶成分种类及含量的差别，对辣木叶原料的质量控制及相关辣木叶产品的开发提供高水平的质控标准，同时也为辣木叶原料的筛选提供科学的评价方式。

表3 9批辣木叶指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 9批辣木叶指纹图谱共有峰相对峰面积

表5 9批辣木叶药材相似度分析