一测多评法同时测定复方玄驹胶囊中7种成分的含量

（南京医科大学附属儿童医院药学部，江苏 南京 210008）

复方玄驹胶囊由淫羊藿、蛇床子、枸杞子和黑蚂蚁4味中药加工而成，主要用于神疲乏力、精神不振、腰膝酸软、少腹阴器发凉、精冷滑泄、肢冷尿频、性欲低下、功能性勃起功能障碍等肾阳虚证的治疗，也可用于改善类风湿关节炎肾阳不足、风寒痹阻证引起的关节疼痛、肿胀等症状[1]。现代研究表明复方玄驹胶囊对肾移植受者勃起功能障碍[2]、慢性前列腺炎[3-4]、早泄[5]、精子顶体酶活性低下[6]等病症疗效显著，也可用于改善子宫内膜薄型不孕症患者内膜容受性[7]。其联合胰激肽原酶、来曲唑、他达拉非、克罗米芬等化药对畸形精子症患者精子核蛋白异常[8]、多囊卵巢综合征[9]、中老年男性继发性阴茎勃起功能障碍[10]、腹型肥胖伴勃起功能障碍[11]、男性少弱精[12]等病症亦有较好的临床治疗效。复方玄驹胶囊现收载于国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS3-014（Z-014）-2003（Z）-2017，标准和文献[13-15]中仅对淫羊藿所含淫羊藿苷进行了定量研究。中药制剂由多味中药材组方而成，每味中药材含有多种化学成分，其临床效果为多种成分共同作用的结果，单一成分难以全面反映中药制剂的产品质量，多组分控制模式已逐步应用于中药制剂的质量评价中。本文采用一测多评法，以欧前胡素为内参物，利用中药各成分间存在的内在函数关系，建立淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素与欧前胡素的相对校正因子，实现对复方玄驹胶囊所含7种主要成分的同时测定，为全面评价复方玄驹胶囊的产品质量提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔公司）；安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AUX120分析天平（日本Shimadzu公司）；CPX8800-C型超声波振荡仪（美国Branson公司）。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516，CAS号：489-32-7，含量：94.2 %），宝藿苷I对照品（批号：111852-201603，CAS号：113558-15-9，含量：99.9 %），欧前胡素对照品（批号：110826-201616，CAS号：482-44-0，含量：99.6 %），蛇床子素对照品（批号：110822-201710，CAS号：484-12-8，含量：99.5 %），儿茶素对照品（批号：110877-201604，CAS号：154-23-4，含量：99.2 %），表儿茶素对照品（批号：110878-201703，CAS号：490-46-0，含量：99.7 %，中国食品药品检定研究院）；佛手柑内酯对照品（批号：PRF8063045，CAS号：484-20-8，含量：99.8 %，成都普瑞法科技开发有限公司）；复方玄驹胶囊（规格：0.42 g/粒，批号：20180706，20190115，20190316，浙江施强制药有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取复方玄驹胶囊适量，倾出内容物，研细，取0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，称重，超声（功率：320 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，用50 %甲醇补重，摇匀，过滤，续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素对照品适量，用50 %甲醇制成各对照品储备液（淫羊藿苷1.414 mg/ml，宝藿苷I0.698 mg/ml，佛手柑内酯0.212 mg/ml，欧前胡素1.286 mg/ml，蛇床子素1.804 mg/ml，儿茶素0.372 mg/ml，表儿茶素1.138 mg/ml）；精密吸取各储备液2.5 ml，置同一50 ml量瓶中，用50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液（淫羊藿苷70.7 µg/ml，宝藿苷I34.9 μg/ml，佛手柑内酯10.6 µg/ml，欧前胡素64.3 µg/ml，蛇床子素90.2 µg/ml，儿茶素18.6 µg/ml，表儿茶素56.9 µg/ml），备用。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按复方玄驹胶囊的处方工艺，制备缺淫羊藿、缺蛇床子和缺枸杞子的3种阴性样品，再按2.1.1项下方法制成3种阴性样品溶液，备用。

2.2 色谱条件

采用Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.5 %醋酸溶液，按表1进行梯度洗脱；检测波长分别为270 nm[16-18]（0～17.0 min检测淫羊藿苷和宝藿苷I）、320 nm[18-20]（17.0～28.0 min检测佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素）和280 nm[21]（28.0～40.0 min检测儿茶素和表儿茶素）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 µl。

表1 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性考察 精密吸取混合对照品溶液、复方玄驹胶囊供试品溶液和3种阴性对照溶液各10µl，按2.2项色谱条件进样检测，色谱图见图1。由图1可见，色谱图基线平稳，目标成分淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素与相邻峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按各目标成分色谱峰计均大于4000，阴性对照溶液色谱图中，在与淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素相应保留时间处无干扰。

2.3.2 线性与范围考察 分别精密吸取2.1.2项下对照品储备液各2.0 ml，置于同一20 ml量瓶中，加50 %甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为混标溶液I，再依次精密吸取混标溶液I各适量，依次用50 %甲醇稀释2倍、4倍、8倍、16倍、20倍，制成混标溶液II～VI，依次精密吸取混标溶液VI～I各适量，进样检测淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的峰面积，以质量浓度（c，μg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

2.3.3 相对校正因子的计算 在标准曲线A=ac+b中，c=（A-b）/a=A/a-b/a，由2.3.2项下各成分标准曲线可知，a/b值均大于100，b/a值可忽略不计。本文采用斜率校正法，以欧前胡素为内参物，按照计算公式fk/s=ak/as（式中ak为内参物标准曲线斜率，as为其他待测成分标准曲线斜率）分别计算淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的相对校正因子。结果淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的相对校正因子分别为0.7768，1.1331，0.9917，0.6610，0.8829和1.1335。

图1 对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的HPLC色谱图

表2 7种成分线性关系和范围

2.3.4 仪器精密度试验 精密量取淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素混合对照品溶液适量，按2.2项色谱条件重复进样6次，记录淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的峰面积，结果各成分峰面积的RSD分别为0.76 %，0.91 %，1.32 %，0.63 %，0.58 %，1.01 %和0.85 %。

2.3.5 重复性试验 取同一批次复方玄驹胶囊适量，按2.1.1项下方法平行制备供试品溶液6份，再按2.2项色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算得淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素含量的RSD分别为1.25 %，1.44 %，0.52 %，1.37 %，1.14 %，0.63 %和1.20 %。

2.3.6 供试品溶液稳定性试验 取复方玄驹胶囊样品，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，于0，2，4，6，10，16，24 h依法进样检测，记录淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的峰面积，结果复方玄驹胶囊供试品溶液24 h内稳定，目标成分色谱峰峰面积的RSD分别为0.72 %，0.88 %，1.24 %，0.57 %，0.63 %，0.99 %和0.81 %。

2.3.7 加样回收率试验 取已知含量的复方玄驹胶囊样品，倾出内容物，研细，取9份，每份0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入加标混合对照品溶液（淫羊藿苷0.455 mg/ml，宝藿苷I 0.237 mg/ml，佛手柑内酯0.059 mg mg/ml，欧前胡素0.434 mg/ml，蛇床子素0.609 mg/ml，儿茶素0.131 mg/ml，表儿茶素0.366 mg/ml）各1.0，2.0，3.0 ml，再按2.1.1项下方法制备加样样品溶液，按2.2项色谱条件依法进样检测，结果所测成分淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的平均加样回收率分分别为98.82 %，97.90 %，96.84 %，99.93 %，98.26 %，97.64 %和99.07 %，RSD分别为0.94 %，1.33 %，1.16 %，0.98 %，1.41 %，1.20 %和1.03 %（n=9）。

2.4 相对校正因子精密度考察

2.4.1 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响 考察UltiMate3000型和安捷伦1260型高效液相色谱仪两个品牌仪器和Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Prep-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3个品牌色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3。

表3 不同仪器、不同色谱柱相对校正因子测定结果

2.4.2 目标成分色谱峰的定位 准确定位各目标成分的色谱峰是“一测多评法”应用的前提，本文采用相对保留时间法，考察UltiMate3000型和安捷伦1260型高效液相色谱仪两个品牌仪器和Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Prep-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3个品牌色谱柱对相对保留时间的影响，结果见表4。

2.5 一测多评法与外标法的比较

取3个批次的复方玄驹胶囊样品各适量，按2.1.1项下方法每个批次平行制备3份复方玄驹胶囊样品溶液，依法进样测定，记录淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的峰面积，先采用外标法计算7种目标成分的含量；再按内参物欧前胡素实测含量，根据2.3.3项下建立的相对校正因子计算淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素的含量，结果一测多评法计算结果与外标法实测结果无明显差异[相对平均偏差（RAD）＜2.0 %]，检测结果见表5。

3 讨论

3.1 目标成分的选择

复方玄驹胶囊由淫羊藿、蛇床子、枸杞子和黑蚂蚁4味中药加工而成，方中淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷I等黄酮类化合物为其主要有效成分，中国药典2015年版一部以淫羊藿苷和宝藿苷I为其定量测定指标；蛇床子为伞形科植物蛇床的干燥成熟果实，主要含香豆素类、挥发油、色原酮、萜类等化学成分，其中佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素等香豆素类化合物为其主要有效成分，中国药典2015年版一部以蛇床子素为其定量测定指标；枸杞子为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，儿茶素、表儿茶素、原儿茶醛、咖啡酸等酚酸类成分为其主要成分；黑蚂蚁为蚁科动物鼎突多刺蚁或双齿多刺蚁的干燥体，具有益气强身、养肝荣筋、补肾驱寒、活血通络的功效，主要含蛋白质、氨基酸类成分。本文选取方中淫羊藿所含代表性成分淫羊藿苷、宝藿苷I，蛇床子所含主要成分佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素，枸杞子所含主要成分儿茶素、表儿茶素为定量测定目标成分，采用一测多评法，建立复方玄驹胶囊中7种成分的多指标控制模式。

表4 不同仪器、不同色谱柱对相对保留时间的影响

表5 样品测定结果（n=3）

3.2 色谱条件的选择

首先以乙腈-水系统为流动相，试验结果发现以乙腈-水[17-19]为流动相进行分析时，蛇床子素峰拖尾现象严重，同时检测时间过长，为改善峰形，缩短检测时间，向水相中加入酸性较弱的醋酸溶液，通过不断摸索，最终确定以乙腈-0.5 %醋酸水溶液[16,20]为流动相，按2.2项下的流动相比例进行梯度洗脱，实现对复方玄驹胶囊中淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素含量的同时测定。

3.3 供试品提取方法的选择

实验中首先对比考察了提取溶剂（50 %甲醇[21]、甲醇[19]、50 %乙醇[16-18]、乙醇[18]）对目标成分淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素综合提取率的影响，结果50 %甲醇为提取溶剂时效果最佳；在此基础上，对提取方式（超声提取[17-20]、加热回流提取[16]）和提取时间（15，30，60 min）进行了对比考察，最终确定采用50 %甲醇超声提取30 min 作为复方玄驹胶囊供试品溶液的制备方法。

本研究以欧前胡素为内参物，测得淫羊藿苷、宝藿苷I、佛手柑内酯、蛇床子素、儿茶素、表儿茶素与欧前胡素的相对校正因子，通过对相对校正因子耐用性的考察和各目标成分色谱峰的定位，验证所建立方法的准确性和可行性。本文所建立的一测多评法操作便捷，准确度高，为全面评价复方玄驹胶囊产品质量提供了参考依据。