正交法优选醋制白屈菜最佳炮制工艺

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

白屈菜为罂粟科植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的干燥全草，主要含白屈菜红碱等生物碱类化合物[1]。现代研究表明，其所含的白屈菜红碱、原阿片碱等属原鸦片碱类，具有中枢抑制作用，有类似吗啡样的镇痛及催眠作用[2]。目前白屈菜饮片除了简单的净制方法外，未见报道其他炮制方法。本课题初步研究结果发现，利用焖制法炮制的白屈菜在汤剂煎煮过程中，其提取率较高，是生品提取率的近两倍。且白屈菜具有止痛的作用，中医理论认为醋制后能引药归肝经，并增强止痛作用。同时，现代研究表明，白屈菜当中含大量生物碱，经炮制特别是醋制后，能更好地发挥白屈菜中生物碱类成分的作用。本研究的主要内容是以白屈菜中原阿片碱等6种生物碱总量为评价指标，采用正交设计法，优选白屈菜的焖法炮制最佳工艺，为白屈菜饮片的进一步炮制研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；安捷伦色谱工作站；SF-130B高速粉碎机（上海冠联）；AS3120超声提取器（天津奥特赛恩斯）；CP225D十万分之一电子天平（Sartorius）；RE5ZCS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

吉林产白屈菜，经辽宁中医药大学药学院王荣祥教授鉴定为罂粟科植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的干燥全草；厨邦9度米醋（广东美味调味食品有限公司）；白屈菜碱（南京源植物生物科技有限公司，批号YZ180424，含量＞99.9 %）；原阿片碱（批号：20170612，含量：99.5 %），盐酸黄连碱（批号：20170719，含量：98.2 %），血根碱（批号：20140717，含量：99.6 %），小檗碱（批号：20160907，含量：99.5 %），白屈菜红碱（批号：20170103，含量：98.1 %，大连美仑生物技术有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团）；盐酸等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取原阿片碱、白屈菜碱、盐酸黄连碱、血根碱、小檗碱和白屈菜红碱对照品，加甲醇配制成浓度分别为0.0160，0.0512，0.0431，0.0218，0.0113，0.0162 mg/ml的混合对照品溶液备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加盐酸-甲醇（0.5:100）混合溶液40 ml，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（0.5:100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 ml，蒸干，残渣加50 %甲醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[3]。

2.2 色谱条件[4-5]

色谱柱为中汇达Kromasil ODS-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：0.1 %三乙胺（用磷酸调节pH值至3.0，A）-乙腈（B）；梯度洗脱条件：0～18 min，24 %B；18～32 min：24 %B→35 %B；检测波长为274 nm；流速为1 ml/min；柱温35 ℃；进样量为20 µl。

2.3 专属性实验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，按2.2项色谱条件测定，结果对照品的分离度良好，且与供试品中的其他成分不干扰。

图1 对照品（A）、白屈菜药材（B）的HPLC图谱

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取含原阿片碱0.80 mg/ml、白屈菜碱1.28 mg/ml、盐酸黄连碱1.0775 mg/ml、血根碱0.545 mg/ml、小檗碱 0.2825 mg/ml和白屈菜红碱0.405 mg/ml的混合对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0 ml，置于25 ml量瓶中，以甲醇定容，按2.2项下色谱条件测定色谱峰面积，以对照品进样量（X，µg）为横坐标，峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表1。结果表明6种对照品均具有良好的线性关系。

表1 6种对照品回归方程及线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取6种对照品，测定，测得6种对照品的峰面积RSD（n=6）分别是1.04 %，1.02 %，1.14 %，0.66 %，1.20 %，0.55 %，说明方法精密度良好。

2.6 重复性试验

取样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，结果6种对照品含量分别为0.51，4.77，4.71，1.30，0.35，1.01 mg/g，RSD（n=6）分别为1.12 %，1.51 %，0.93 %，1.61 %，1.02 %，1.74 %，说明方法重现性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品，按2.2项下色谱条件，于0，2，4，8，12，24 h进样测定，结果6种对照品的峰面积RSD（n=6）分别为1.59 %，1.85 %，0.63 %，1.04 %，0.80 %，0.92 %，表明样品在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验

取样品粉末6份，每份约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含原阿片碱1.01 mg/ml、白屈菜碱9.71 mg/ml、盐酸黄连碱9.51 mg/ml、血根碱 2.58 mg/ml、小檗碱0.70 mg/ml和白屈菜红碱2.04 mg/ml的混合对照品溶液10 ml，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项色谱条件进行HPLC测定，计算回收率，平均回收率分别为97.5 %，99.4 %，100.8 %，99.7 %，98.9 %和98.6 %，RSD分别为2.41 %，2.41 %，2.32 %，2.33 %，2.01 %和1.81 %，符合相关规定。

2.9 正交设计及含量测定结果[6-7]

前期研究采用炙法、烘法、蒸法、焖法和煮法对白屈菜进行炮制，结果发现，焖法总生物碱含量为11.98 mg/g，是5种方法中生物碱含量最高的，接近于生品（12.61 mg/g），于是采用焖法进行正交试验研究，以醋用量、焖润时间、烘干时间和烘干温度为因素，各取3个水平，因素水平见表2；按表3进行正交试验，因素指标相关图见图2。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交设计及含量测定结果

图2 因素指标相关图

对表3数据进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析表

直观分析表明，其最佳组合为A3B2C3D1，各因素影响顺序为A＞B＞D＞C。方差分析表明，A和B因素差异有统计学意义，加醋量3水平最佳，即醋用量30 %；焖润时间2水平最佳，即焖润2 h，C和D因素差异无统计学意义，选择烘干时间20 h，烘干温度60 ℃。因素最佳组合为A3B2C3D1，即醋用量30 %，焖润2 h，60 ℃下烘20 h。

2.10 验证试验

称取白屈菜3份，每份约100 g，分别加30 g米醋拌匀，焖润2 h，60 ℃下烘20 h。按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行HPLC测定。结果平均含量为11.89 mg/g，RSD为1.08 %，表明优选出的工艺可靠。

3 结论

本研究所建立白屈菜的HPLC含量测定方法，简单易行，可用于白屈菜样品的含量测定。以原阿片碱等6个生物碱成分的总量作为醋制工艺评价指标，具有一定的客观性。经正交试验优选出醋制白屈菜的最佳工艺条件为：醋用量30 %，焖润2 h，60 ℃下烘20 h。