TSK凝胶色谱系统测定注射用盐酸头孢替安有关物质II

（山东鲁抗医药股份有限公司，山东 济宁 272100）

注射用盐酸头孢替安是第二代头孢菌素类抗生素，为盐酸头孢替安原料加适量助溶剂碳酸钠制成的注射用无菌粉末。临床上，该品种广泛应用于敏感菌导致的各种感染性疾病，最早由日本武田药业研制成功并上市[1]。本品属β-内酰胺类抗生素，为减少过敏反应，必须控制内源性高分子杂质[2-3]。目前已有有关注射用盐酸头孢替安聚合物测定方法的报道，大多采用 G-10凝胶色谱柱[4-5]进行检测，但头孢替安在水中缔合差，常采用头孢他啶或头孢曲松等替代头孢替安作为对照品，不能实现用头孢替安自身作为对照品直接测定，且存在柱效低、分离效果差、费时费力、成本高、灵敏度差等缺点。目前不少文献报道了高效分子排阻色谱法（HPSEC）[6-7]测定抗生素中聚合物含量的方法，与传统的G-10凝胶法相比，该法灵敏度高、简便易行、不需要经常对色谱柱进行活化处理，可实现对头孢类抗生素中高聚物的快速分析。本实验采用分子排阻色谱法来检测注射用盐酸头孢替安中的高分子杂质（有关物质Ⅱ）的含量，并通过系统研究验证了该分析方法的可行性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

赛默飞Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国热电公司）；梅特勒-托利多AB265-S电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药

头孢替安对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130565-200902，含量80.7 %）；3批原研样品（日本武田药业，批号：C43113，C43111，CL0947）；12批注射用盐酸头孢替安（批号：170101～170112）；乙腈（色谱纯，Fisher）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠（分析纯，国药集团）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：TSK-GEL 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 µm）；流动相：pH 7.0的0.005 mol/L磷酸盐缓冲液[磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠溶液（50:50)]-乙腈=90:10；柱温：25 ℃，检测波长：254 nm，进样量：10 µl。

2.1.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称定头孢替安对照品适量，以流动相溶解并稀释制成10 µg/ml（以头孢替安计）的溶液。

供试品溶液（临用新制）：精密称定注射用盐酸头孢替安样品内容物适量，以流动相溶解并稀释制成每毫升约含头孢替安1 mg的溶液。

系统适用性溶液：取注射用盐酸头孢替安样品内容物适量，用流动相溶解并制成每毫升约含头孢替安1 mg的溶液，80 ℃水浴中加热2 min，冷却至室温。

灵敏度溶液：精密量取10 µg/ml的头孢替安对照品溶液1 ml，用流动相定量稀释成每毫升约含头孢替安0.2 µg的溶液。

2.1.3 有关物质II测定 分别精密量取2.1.2项下对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、灵敏度溶液各10 µl进样。系统适用性溶液中头孢替安峰与相对保留时间约为0.95的降解产物峰间的分离度应符合要求，灵敏度溶液主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10；以外标法计，供试品溶液色谱图中保留时间小于头孢替安峰的杂质总量不得过标示量的2.0 %，小于灵敏度溶液主峰面积的杂质峰可忽略不计。

2.2 分析条件的优化

通过对流动相、波长、溶剂、进样量等条件进行优化，确定最佳试验条件。

2.2.1 流动相的选择 为了考察流动相中乙腈比例对检测结果的影响，分别考察0.005 mol/L磷酸盐缓冲液、0.005 mol/L磷酸盐缓冲液:乙腈=95:5、0.005 mol/L磷酸盐缓冲液:乙腈=90:10为流动相时对分离效果的影响。结果表明，当乙腈比例为10 %时，主峰及主峰前杂质的峰形最好，主峰前的杂质数最多，有关物质Ⅱ含量相对最大（色谱图见图1）。为考察流动相中磷酸盐浓度的影响，固定乙腈比例为10 %，分别比较当磷酸盐浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L时的分离效果，发现0.005 mol/L的磷酸盐可检出的杂质含量较大，且流动相中含盐浓度低，对色谱柱寿命影响相对较小，更符合方法学要求。

图1 注射用盐酸头孢替安有关物质II检测图谱

2.2.2 检测波长的选择 采用PDA检测器，对头孢替安及其主峰前杂质（杂质1～杂质7及相对保留时间约为0.95的热破坏降解杂质8，见图2）在200～400 nm波长内进行扫描，评价主峰及主峰前杂质的紫外吸收行为。实际测得头孢替安最大紫外吸收波长为254 nm，保留时间小于头孢替安的杂质在254 nm处均有较明显吸收，故选择254 nm为测定波长是合理的。

2.2.3 溶剂选择 本品由于添加了辅料碳酸钠，易溶于水，分别采用水和流动相作为空白溶剂，比较二者的色谱行为。结果表明，以水做空白溶剂时，所得图谱有小的倒峰出现，而流动相则未检出任何峰，不会对检测产生干扰，因此选择流动相为溶剂更佳。

图2 注射用盐酸头孢替安有关物质II系统适用性图谱

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 分别取本品及碳酸钠各适量，分别取经高温降解（80 ℃水浴加热2 min）、酸降解（2 mol/L盐酸溶液破坏40 min）、碱降解（0.1 mol/L氢氧化钠溶液破坏15 min）、强光照射（4500±500 lx强光下放置6.5 h）、氧化降解（3 %过氧化氢溶液破坏10 min）后制成的溶液，结果表明，辅料碳酸钠在各降解条件下均不影响测定；本品在以上破坏条件下均不稳定，产生的各降解产物峰与头孢替安峰分离度均＞1.5，各检测溶液中主峰纯度匹配指数均大于980，说明主峰的纯度符合要求，未包裹其他杂质峰，该方法的专属性良好，见图3（热破坏见图2）。

图3 注射用盐酸头孢替安溶液破坏图谱

2.3.2 进样精密度 取10 µg/ml的头孢替安对照品溶液，按2.1项下方法连续进样6次，测得主峰峰面积的RSD为0.50 %。

2.3.3 定量限与检测限 取头孢替安对照品溶液，采用逐步稀释的方法，信噪比（S/N）=10的样品浓度即为定量限，信噪比（S/N）=3的溶液浓度即为检测限。结果定量限溶液的浓度为0.03 μg/ml，检测限溶液的浓度为8.02 ng/ml，6份定量限溶液峰面积的RSD为3.69 %。

2.3.4 对照品溶液线性关系与范围 以20 µg/ml的头孢替安对照品溶液为储备液，分别精密量取该储备液0.1，1.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0 ml于10 ml量瓶，以流动相稀释并定容至刻度，作为线性溶液。结果表明，头孢替安在0.19～19.05 μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y=0.4131X-0.0070，相关系数（r）为0.9999。

2.3.5 有关物质Ⅱ总峰面积与头孢替安浓度的线性关系 分别取供试品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 ml含头孢替安0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.8 mg的溶液，作为不同浓度的线性溶液。分别取上述各线性溶液10 μl进样分析，求算各线性溶液浓度与响应值（主峰前有关物质Ⅱ峰面积总和）回归方程及相关系数。结果表明，供试品溶液在浓度为0.38～1.86 mg/ml的范围内与头孢替安有关物质Ⅱ总峰面积具有良好的线性关系，线性方程为Y=2.2800X-0.0513，相关系数r为0.9999。

2.3.6 重复性与中间精密度 两位分析员分别配制6份供试品溶液和2份头孢替安对照品溶液，在不同时间，采用两台不同仪器，取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别进样分析。结果表明，两位分析员6次测定重复性RSD分别为1.42 %和1.31 %，不同分析员12次测定中间精密度的RSD为1.60 %。

2.3.7 溶液稳定性试验 将供试品溶液分别在室温和4 ℃环境下放置，考察其稳定性，结果见表1。结果表明：有关物质Ⅱ总峰面积随时间延长逐渐变大；室温下，聚合物含量增长较快，说明温度影响其稳定性。因此，供试液需临用新制，或低温放置一定时间内进样。

2.3.8 耐用性 分别改变波长±5 nm、流速±0.1 ml/min、柱温± 2 ℃、流动相pH± 0.2、流动相配比±2 %、色谱柱批号等色谱条件，评价波长、流速、柱温、pH值、流动相配比、色谱柱批号改变后对实验结果影响程度。结果表明，与原色谱条件比，检测结果相对偏差（RD）均小于5 %；说明色谱条件略有变化时，对检测没有影响，该方法检测盐酸头孢替安有关物质Ⅱ耐用性良好。

2.4 样品检测

取12批某公司生产的注射用盐酸头孢替安样品及日本武田生产的3批样品，按2.1项下方法进样检测，结果见表2。

表1 注射用盐酸头孢替安有关物质II溶液稳定性考察结果

表2 注射用盐酸头孢替安有关物质II样品检测结果

3 讨论

由于头孢类抗生素在TSK-GEL 2000SWXL色谱柱中，除分子排阻作用外，还可能存在吸附作用，保留时间并非严格按照分子排阻原理，因此主峰前的杂质峰不仅包括了高分子聚合物，还可能包括其他极性大的小分子杂质，参考《中国药典》2015年版（二部）正文中头孢地嗪钠、头孢米诺钠、法罗培南钠等品种[8]，将主峰前的杂质峰总和统称为有关物质Ⅱ。系统的方法学研究表明，该法操作简便、专属性强、灵敏度高、结果可靠，适用于注射用盐酸头孢替安中有关物质Ⅱ的快速检测。由于注射用盐酸头孢替安室温下溶液稳定性较差，因此需临用新制或低温储存。