家畜精子冻干保存技术研究进展

于 洋，房晓欢，李俊杰,2*，王志刚,2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定 071000）

精子冻干保存（Freeze-Drying，FD）是指利用真空冷冻干燥，使精子处于失水干燥状态保存于室温或低温环境的一种技术，虽然冻干保存处理后的精子失去活力，但仍具有受精能力，这对于拯救濒危物种具有重要意义[1-2]，甚至某些物种已经用冻干保存精子建立起精子库。生物体未经干燥而保存在室温中是不稳定的，会受到微生物的降解甚至发生变性，而无水生物除了能抵抗干燥的不利环境外，还可承受冷冻、高温、有机溶剂和电离辐射的影响。冻干保存精子可在室温下储存[3]，且小鼠冻干保存后的精子核可耐受-196～150℃极端温度以及空间站上强烈的阳光辐射[4-5]。因此，冻干保存精子对于外界环境有很强的耐受性。此外，与超低温保存相比，精子冻干保存不需要经常补充液氮，并且室温储存成本低廉，便于运输，但其加工时间长、能耗高和投资成本高等缺点，尤其是冻干保存精子会因快速冷冻和强力干燥而破坏精子膜，使其失去活力，尚不能应用于人工授精和试管婴儿，但其DNA 可被完整保留，因此可利用胞浆内单精子显微注射（ICSI）技术将精子注射到卵母细胞中以获得后代。但冻干保存精子的DNA极易断裂，这成为制约该技术发展的重要瓶颈之一[6]。本文通过对精子冻干保存技术的原理、程序等进行综述，以期为精子的长期保存提供依据。

1 精子冻干保存技术的发展

通过冻干保存技术将细胞保存于干燥状态具有广阔的应用前景。最初冻干保存保存的样品主要是细菌、病毒和其他微生物，1998 年Wakayama 等[7]首次报道利用小鼠冻干保存精子进行ICSI 并获得后代。表1 总结了一些哺乳动物的FD 精子的研究结果。

表1 不同哺乳动物的冻干精子研究结果

2 冻干保存技术原理

冻干保存技术包括冷冻和干燥两个过程，即先将混合好的精液和冻干保存保存液冷冻，然后进行升华（初次干燥）和解吸（二次干燥），最终将溶剂减少到无法支持生物生长或产生化学反应。冷冻主要是分离溶剂和溶质，溶剂会形成冰晶，而溶质将被限制在冰晶间的空隙内。干燥过程可通过冰的升华来实现[23]，其目的是将水充分去除，以便使样品不发生化学或生物反应而长期保存。在初次干燥过程中，冷冻干燥机的压力降低，温度升高，从而使样品中的冰晶升华，随着升华进行，样品中的冰-气界面逐渐消退，当所有的冰晶从样品中升华后，初次干燥完成。但此时样品表面仍会吸附一定的水分，可通过二次干燥提高样品温度和降低水蒸气分压来完成剩余水的最终解吸。

3 冻干保存精子的制作工艺

冻干保存精子的制作工艺主要包括精子样品制备、冻干保存试剂处理、冷冻干燥、样品贮存[24]。

3.1 精子冻干保存保存的关键试剂 冻干保存试剂一般为均匀稳定的盐溶液，具有适宜的渗透压和pH，易于干燥，可提供稳定的再水化环境。目前，最简单的稳定维持精子生育能力的方法是向冻干保存溶液中加入10 mmol/L Tris 和1 mmol/L EDTA，并且所需溶液pH 为8.0[25]。精子冻干保存的关键试剂主要有胎牛血清、核酸内切酶抑制剂、海藻糖、迷迭香酸等。

胎牛血清含有细胞生长所必需的丰富营养成分，是细胞培养中用量最大的天然培养基。在小鼠[7]、马[21]和牛[17,26]等动物上均证实，冻干保存溶液中添加胎牛血清（FCS）有助于提高冻干保存精子成功率，且浓度以10%为宜。

核酸内切酶抑制剂可抑制DNA 降解，对于冻干保存精子DNA 完整性具有重要作用。2001 年，Kusakabe等[27]研发了一种含EGTA（可抑制内切酶活性）的冻干保存精子试剂，随后Kaneko 等[9]用同样具有内切酶活性的EDTA（乙二胺四乙酸）取代 EGTA，并证实添加少量 EDTA 有利于保持小鼠精子染色体完整性和受精能力。兔[28]和猪[29]的冻干保存精子研究证实，EDTA的效果优于EGTA。但对马[30]和狗[31]的冻干保存精子DNA 完整性的检测结果均发现，EGTA 相比于EDTA更能有效防止DNA 损伤。可见，核酸内切酶抑制剂的效果因物种而异，需根据实际情况加以选择。

海藻糖是冻干保存精子研究中应用最广的一类非还原性双糖，其突出优点是具有较高的玻璃化转变温度和稳定性，能够在极端环境下保持稳定并保护精子细胞膜和蛋白质。Oldenhof 等[32]对马冻干保存精子研究发现，海藻糖在冻干保存过程中会被吸收，极大地减少精子储存过程中的DNA 降解。研究表明，小鼠冻干保存溶液中添加海藻糖可显著提高ICSI 后2-细胞胚胎发育至囊胚的比例[33]。

迷迭香酸是天然抗氧化剂，具有抗增殖、抗自由基和抗氧化作用。在绵羊、猪、狗精子的冻干保存溶液中加入迷迭香酸均可降低精子DNA 的损伤程度，且迷迭香酸处理的冻干保存精子的囊胚发育率与常规冷冻保存精子无显著差异[29,31,34]。

此外，冻干保存精子保存液的酸碱度对精子的冻干保存也起关键作用。Kaneko 等[35]报道微碱性（pH=8.0）溶液有助于保持小鼠精子染色体完整和受精能力。随后，小鼠[8,35]、牛[18]、猪[36]、兔[15]等不同物种的多项实验均证实冻干保存精子保存液最适pH 为8.0。

3.2 精液处理方法 用于冻干保存的精液样品可以是新鲜或冷冻精液，其处理程序通常包括离心、洗涤等，但不同物种间存在一定差异。小鼠、猪、马、兔、犬等动物通常采用新鲜精液进行冻干保存处理。其中，小鼠、猪和马精液采集后通常添加稀释液，经离心去除上清后再加入冻干保存溶液离心，以充分洗涤精子，之后将精子悬液转移至离心管中，经预冷处理后移入冷冻干燥系统[20-21,32,36-37]。而兔和犬的精液采集后通常直接转入FD 溶液中，孵育10 min 后进行冷冻干燥处理[15-16]。牛的冷冻精液质量较高且实现了商业化，因此对牛精子的FD 处理既可采用冷冻-解冻精液[17-18]也可利用新鲜精液[26]。

3.3 精子冻干保存压力和时间 冻干保存包括冷冻、初次干燥和二次干燥3 个阶段。真空状态下更有利于冰的升华，因此冻干保存过程要在真空中进行。真空压力和干燥时间的相互作用会影响精子干燥程度，进而对冻干保存精子产生较大影响[24]。不同物种精子冻干保存过程所需的压力和时间如表2 所示。Kawase 等[10]研究表明，真空压力对于小鼠精子的初次干燥至关重要，当真空压力为0.37 mbar 时，囊胚发育率显著高于0.04 和1.03 mbar。Kwon 等[20]研究发现，将猪精子冻干保存处理时间从4 h 延长至24 h，会大大降低冻干保存精子的胚胎发育能力。

表2 不同物种的精子FD 压力与时间一览表

3.4 冻干保存精子的贮存温度和时间 有研究表明，小鼠冻干保存精子分别在4℃和25℃中存储3 个月，均不影响其受精后胚胎的发育能力[7]。同样，兔FD 精子分别在4℃与25℃中保存8 个月也不影响其DNA 完整性[28]。但Kwon 等[20]研究发现，猪冻干保存精子储存于25℃中与储存在4℃相比，ICSI 后胚胎发育率显著降低，且无法发育至囊胚。同样，储存在4℃的狗冻干保存精子DNA 损伤率也显著低于22℃[31]。可见，低温更有利于冻干保存精子贮存，且4℃保存更经济，更有利于长期储存和运输，是保存冻干保存精子的理想温度。

4 存在的问题与研究方向

迄今为止，除啮齿类动物外，利用冻干保存精子尚未达到令人满意的效果。诸多因素影响了冻干保存精子在家畜中的应用，尤其是冷冻过程因冰晶形成、渗透脱水和机械力的作用，可能导致精子发生不可逆的结构变化。在今后研究中，可针对不同物种的特性，深入研究如何改善缓冲液组成以制备理想的冻干保存精子保存液。此外，应对冻干保存过程中的压力、温度和时间的改进，将有助于冻干保存精子的长期保存。另外，进一步改善ICSI 技术，提高注入冻干保存精子后卵母细胞的发育能力，最大限度地减少技术本身对卵母细胞的损伤，提高其后续的激活能力，也有利于冻干保存精子的应用。