三河牛无角基因鉴定及来源探析

张 可，纪皓楠，柴 河，姜立鑫，赵 曼，佟 彬，郭 峰，吴宏军，刘爱荣，王雅春*，张 毅*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.海拉尔农牧场管理局谢尔塔拉农牧场，内蒙古呼伦贝尔 021012；3.内蒙古大学生命科学学院，省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古呼和浩特 010071；4.内蒙古通辽市畜牧业发展中心，内蒙古通辽 028000）

三河牛是我国自主培育的乳肉兼用牛品种，起源于内蒙古呼伦贝尔额尔古纳右旗的三河地区（根河、哈乌尔河、得勒布尔河）及呼伦贝尔市境内滨州铁路沿线一带。自品种育成以来，三河牛一直保持品系选育的育种方法[1]，除了高产奶系和高产肉系，还选育形成一个无角品系，在当地俗称“秃头系”，具有争斗少、易管理的优点。

目前已报道的牛无角基因主要有3 个独立的来源：安格斯牛、西门塔尔牛等肉牛和兼用牛品种中的凯尔特无角基因（Celtic），荷斯坦牛、娟珊牛等奶牛品种中的弗里生无角基因（Friesian），在蒙古国的牛和牦牛中发现的蒙古牛无角基因（Mongolian）[2]。这些无角基因均定位于牛1 号染色体起始区域，但突变类型各不相同[3]。凯尔特无角基因是一段长度为212 bp 的重复，代替了长度为10 bp 的原序列，即P202ID位点[4]；弗里生无角基因源于一个长度80 kb 片段的重复，即P80kbID位点[4]；蒙古牛无角基因则是一个长度219 bp 的重复片段的插入，即P219ID位点[5]。此外，最近在南美洲的尼尔洛牛（Nellore）中新发现一个瘤牛特异的无角基因，序列特征为一个110 kb 片段的重复[6]。

牛的无角性状属于常染色体显性遗传[7]，因此携带任何一种无角基因均呈现无角。三河牛的培育过程经历了多品种杂交，含有本地牛、西门塔尔牛、西伯利亚牛、俄罗斯改良牛、后贝加尔土种牛等众多品种的血缘[1]，目前关于三河牛无角基因的具体来源尚不清楚。因此，本研究通过对三河牛和蒙古牛的无角基因进行分子检测，探究三河牛无角基因的来源，从而为三河牛无角品系的高效选育提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样本及其基因组DNA 的提取 从内蒙古谢尔塔拉农牧场选择三河牛无角品系公牛3 头，有角公牛4 头（图1），收集冷冻精液样本。在内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗采集21 头蒙古牛的血液样本。利用试剂盒（基因组DNA 提取试剂盒DP304，北京天根生化科技有限公司）提取血液样本DNA；利用高盐法[3]提取牛冻精基因组DNA。利用Thermo Scientific NanoDrop 2000 检测基因组DNA 质量和浓度，剔除经检测不合格的样本1 个。此外，选择基因型已知的无角西门塔尔牛（Celtic 无角基因）和无角荷斯坦牛（Friesian 无角基因）各1 头为对照[3]。

图1 无角三河牛和有角三河牛

1.2 引物合成与PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳

1.2.1 引物合成 检测3 种无角基因的特异性引物序列来自文献报道（表1），由擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 3 种无角基因分子检测PCR 引物信息

1.2.2 目标序列扩增与凝胶电泳 PCR 反应体系总体积20 µL，其 中10×Buffer 2 µL，dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）1.6 µL，Taq 酶（5 U/µL）0.15 µL，上下游引物（20 µmol/L）各0.5 µL，基因组DNA 模板1 µL（约50 ng），ddH2O 14.25 µL 补齐剩余体积。PCR 反应条件：95℃预变性8 min；然后35 个循环，95℃变性30 s，在引物对应的退火温度下复性30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。

制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取PCR 产物4 µL点样，在TAE 缓冲液中110 V 电压下电泳20 min，在凝胶成像系统中观察电泳结果。各样本编号对应牛只信息如表2 所示。

表2 29 个样本3 种无角基因的分子检测结果

1.3 PCR 产物测序验证 PCR 产物的琼脂糖电泳条带经切胶回收后进行测序。使用Chromas 软件查看测序结果，使用ContigExpress 软件拼接和校对正反向测序序列，使用MEGA-X 软件（https://megasoftware.net）进行个体间序列对比。对蒙古牛无角基因辅以克隆测序进行验证。

2 结果

2.1 PCR 扩增产物凝胶电泳检测结果 由图2 可知，蒙古牛无角基因位点（P219ID）检测结果中长度为895 bp的条带对应野生型，长度为1 112 bp 的单条带对应无角基因，双条带对应无角杂合子（图2A）。根据电泳条带可以得知，样本中2 头无角蒙古牛（M1 和M2）的基因型为P219ID位点杂合子；3 头无角三河牛中，有2头（301 和83245）的基因型为P219ID杂合子，1 头（15233）为P219ID纯合子，所有有角个体的基因型都属于野生型。另外，所有蒙古牛和三河牛样本均没有检出欧洲牛特有的凯尔特无角基因（P202ID位点）以及弗里生无角基因（P80kbID位点）（图2B、2C）。

图2 3 种无角基因的PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 验证实验结果 为了验证PCR 产物凝胶电泳分型的准确性，对P219ID位点电泳产物中来自无角个体的条带进行切胶回收和Sanger 测序，长度为1 112 bp 的条带配合使用克隆测序，杂合个体的两条带均进行测序。

测序结果显示，P219ID位点无角等位基因相对于野生型原序列是一种复杂的突变，有3 处变异：1）原序列（219 bp，基因组位置Chr1:1 976 128～1 976 345 bp，参考基因组版本Bos_taurus_UMD_3.1.1）下游间隔61 bp 存在1 个新拷贝（219 bp）；2）原序列上游621 bp处有1 个缺失-插入变异（7 bp 序列替换为6 bp 序列）；3）第一个拷贝中相对野生型序列有1 个单碱基突变（C →G）（图3）。这3 个变异同时出现，故很可能是完全连锁的。本研究测序发现，三河牛无角纯合子个体（15233）及杂合子个体（301、83245）的1 112 bp条带（突变型PCR 片段）均检出了以上2 种特征性突变，蒙古牛无角杂合子个体（M1、M2）的1 112 bp 条带也呈现了相同的测序结果，而三河牛与蒙古牛野生型个体及无角杂合子个体的895 bp 条带（野生型PCR 片段）的测序结果则均与野生型参考序列相吻合（图3）。

图3 蒙古牛类型无角基因突变位点在基因组上的位置与分型引物示意图及试验样本在对应位点的测序结果

3 讨 论

牛角作为牛科动物特有的身体结构，是长期自然选择的结果[8-9]，但在现代规模化养殖中，牛角成为影响生产安全的因素。目前牛场生产中一般在犊牛时期使用机械或化学方法去角，但这不仅会造成动物的应激、影响生长，也不利于动物福利[10-11]。因此，国际上一直在研究培育天然的无角牛品种来摆脱这样的困境[12-13]。除了常规育种之外，也有利用基因编辑技术快速培育无角牛的先例[14]。我国科学家还开展了牦牛无角基因的定位研究[15-16]和无角牦牛品种的选育[17]，并在2019 年培育出无角牦牛品种——阿什旦牦牛。三河牛是我国1983 年正式命名的乳肉兼用牛品种，培育过程是以内蒙古额尔古纳右旗三河地区的蒙古牛为主要母本，以西门塔尔牛、西伯利亚牛、俄国改良牛等外来品种为父本经长期杂交和选育而成。三河牛毛色以红白花为主，体质结实匀称，头部清秀，蹄质坚实，产奶量和乳脂率、乳蛋白率较高且产肉性能优良；另外，三河牛还具有优良的适应性和抗病能力、较高的繁殖率[1]。当前三河牛饲养中仍然主要使用人工去角，但本研究结果有望加快其无角品系的培育，使三河牛具备更加突出的优势。

蒙古牛无角基因最早由Medugorac 等[5]通过基因组测序在蒙古国当地牛（Mongolian Turano cattle）上发现，谷明娟等[18]在我国北方的无角蒙古牛中也检测到这一基因类型。该位点无角基因在我国的部分培育牛品种中也有报道，如云岭牛[19]、蜀宣花牛[20]，但在这些品种中，蒙古牛无角基因频率很低，而凯尔特（Celtic）无角基因更为常见。本研究发现三河牛的无角基因与蒙古牛的无角基因序列相同，都属于Mongolian 无角基因类型（P219ID）。结合三河牛的育种过程可知，三河牛的无角基因来源于蒙古牛。颜泽等[3]采用整合竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR,KASP）技术对1 头三河牛无角个体的无角基因类型进行了检测，结果与本研究相符。同时，电泳分型结果与测序结果的一致性也验证了基于PCR 技术的蒙古牛无角基因分子检测方法的准确性。

本研究鉴定了1 头三河牛无角纯合种公牛，由于目前仍保存了该公牛一定数量的冷冻精液，相比于利用年限较短的母畜，这一无角纯合种公牛个体冻精的有效使用更加有利于无角三河牛群体的扩大[21]。由于无角是显性遗传，使用无角纯合子公牛配种，后代都携带无角基因，表型全部为无角，因此在未来较长一段时间内可以继续利用其冻精进行三河牛无角品系的培育。生产中天然的无角性状属于有利性状，但三河牛的育种目标始终是提升其综合性能，不能顾此失彼，因此在利用分子技术手段准确筛选无角基因的同时，需要对重要经济性状不断进行选育；与此同时，通过丰富种公牛血缘从而避免近交，才能最终获得性能优异且天然无角的优良三河牛品系。

4 结 论

本研究通过分子检测方法鉴定了三河牛无角性状的基因型，证明其无角基因来源于蒙古牛，丰富了对我国牛品种遗传资源特色性状的认识，也为选育我国无角牛品种提供了技术支撑。