王中杭,陈灵君,章亦武,丁浩轩,冯 杰
(浙江大学饲料科学研究所,浙江省动物营养重点实验室,浙江杭州 310058)
适宜水平的自由基能够调控细胞分化、发挥信号传导等功能[1],而当机体遭受刺激时,体内会生成过量的活性氧(ROS)和大量的活性氮自由基(RNS),若自身抗氧化系统无法及时清除这些多余的自由基,便会发生氧化应激。诱发动物产生氧化应激的因素很多,如断奶、分娩过程、环境剧烈变化等。氧化应激会导致DNA 损伤、脂质过氧化和蛋白质降解,对动物肝脏、肠道等组织器官造成损伤,影响动物健康,降低动物生产性能[2]。从营养调控方面缓解生产中氧化应激,可以有效减轻氧化应激对畜牧业造成的负面效应。
目前研究表明,锌作为动物必需的微量元素之一,其通过调控体内多种酶的活力,影响蛋白质、核酸的合成以及细胞的增殖、分化等许多细胞活动[3]。适量补锌不仅可以提高动物繁殖性能、改善肠道健康等,而且会增强机体抗氧化功能,提高免疫力[4-5]。动物缺锌可能导致锌依赖性抗氧化功能下降,氧化应激易感性随之增加。基于目前畜禽养殖行业中易出现氧化应激的问题,使得抗氧化应激相关研究得到更多关注。本文综述了锌的抗氧化机制及其在动物生产中的研究进展,以期为锌元素在畜禽养殖中的合理使用提供参考。
1.1 锌调控自由基的产生与猝灭 锌具有调节多种蛋白质活性的能力,其可能是锌调节ROS 和RNS 产生的基础。锌可直接抑制NADPH 氧化酶活性,减少自由基的产生。缺锌则引起NADPH 氧化酶活性的增加,进而导致NADPH 含量降低,而NADPH 是产生具有抗氧化作用的谷胱甘肽(GSH)和保持谷胱甘肽还原酶活性所必需的[6],故NADPH 含量的降低会引起自由基的增加。锌可通过调节N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)进而影响神经元细胞中NO 和超氧阴离子(O2-)的产生,锌与受体通道孔内外2 个位点结合,抑制NMDAR激活;缺锌则会引起NMDAR 活化导致孔的开放,钙和其他阳离子从细胞外空间进入细胞,钙离子(Ca2+)可与钙调素(CaM)结合,激活NO 合酶(NOS),从而引起NO 的生成增加;Ca2+浓度上升还可激活蛋白激酶C(PKC),进而激活NADPH 氧化酶,NADPH 氧化酶可催化O2-的形成[7-9]。锌通过影响同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)的代谢来减少自由基的生成。过量Hcy 会促进自由基的产生,引起机体氧化应激加重,而Hcy 主要通过2 个渠道进行代谢。其一条为转硫途径,涉及胱硫醚β-合成酶(Cystathionineβ-synthase,CBS)催化同型半胱氨酸到胱硫醚的硫转移,其可以进一步形成半胱氨酸和GSH,而CBS 受Sp1 及其他锌依赖性转录因子的调控[10];第二条为甲基化途径,主要受甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)和甲硫氨酸合成酶(MS)调控,而它们均为锌金属蛋白酶[11]。因此,锌可通过调节锌金属蛋白酶及锌依赖性转录因子进而促进Hcy 的代谢,减轻机体氧化损伤。
1.2 锌可直接激活抗氧化酶活性 GSH 为疏基含量最高的非蛋白质,在保护机体免受氧化损伤方面具有重要作用[12]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)能够利用GSH将过氧化氢转化为水,避免机体发生氧化损伤[13]。缺锌时机体容易发生脂质过氧化,GSH-Px 耗竭也会引起GSH-Px 活性下降[14]。补锌可通过提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,增强机体清除ROS 的能力。SOD 能将O2-转化为水保护细胞免受损伤,对机体的氧化还原平衡起着重要作用。根据金属辅基的不同,机体内SOD存 在Fe-SOD、Mn-SOD 及Cu/Zn-SOD 3 种形式,而锌是Cu/Zn-SOD 的辅因子[15]。因此,补锌可通过提高SOD 活性增强机体清除ROS 的能力。
1.3 锌调控抗氧化蛋白的合成 激活核因子E2 相关因子2(Nrf2)作为一种转录因子能够调控抗氧化蛋白的表达,Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)是Nrf2 的胞浆抑制蛋白,其可调节Nrf2 的激活;当机体生理状态处于正常时,Nrf2 与胞浆抑制蛋白Keap1 结合而发生泛素化和蛋白酶体降解,使其保持一般水平;当机体发生氧化应激时,Keap1 的构象会发生改变,导致其介导的泛素化对Nrf2 的降解作用减弱[16],Nrf2 水平增加,其核易位与小Maf 蛋白结合形成异二聚体后再与抗氧化反应元件(ARE)结合[17],进而启动下游一系列抗氧化物质(如谷氨酰半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽S 转移酶等)的表达[7]。锌能够通过激活信号通路蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β),减少Fyn 蛋白对 Nrf2 的转运与降解,影响Nrf2 的表达[18]。同时,锌作为细胞内的第二信使,能够通过刺激Keap1调控Keap1-Nrf2 通路[7]。此外,锌还可通过调控Nrf2促进GSH 的合成[19]。
1.4 锌参与金属硫蛋白介导的抗氧化功能 锌可调控锌代谢相关蛋白进而调节金属硫蛋白(MT)基因的表达。MT 不仅是一种金属结合蛋白,也是过氧化物和自由基的有效清除剂。在评估空腹应激引起肝脏MT 抗氧化特性的试验中发现,禁食24 h 后过氧化氢酶、Mn-SOD和GSH-Px 活性没有发生改变,而肝脏MT 合成显著增加,表明MT 在禁食状态下作为抗氧化剂起着核心作用;同时禁食应激可提高肝脏脂质过氧化水平,而禁食应激前48 h 和24 h 皮 下注射ZnSO4(300 mmol/kg)可显著提高禁食24 h 小鼠肝脏MT 水平,缓解空腹应激引起的脂质过氧化水平[20]。锌可通过直接与金属转录因子1(MTF-1)结合导致其活化,MTF-1 与存在于MTI和MTII 启动子中的金属响应元件相结合,诱导MT基因表达增加[21]。锌离子也可通过磷脂酰肌醇-3 激酶(PI-3K)/Akt 信号转导通路,间接调节并使转录因子CCAAT/ 增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)磷酸化,C/EBP-α也能够上调MT基因转录,与MTF-1 具有协同作用[22-23]。黄燕萍等[24]通过缺锌日粮干预怀孕母鼠建立的缺锌小鼠模型,其肝脏锌含量及血清Cu/Zn-SOD活性、MT 含量极显著低于正常小鼠,表明小鼠抗氧化力减弱与先天机体锌含量相关。
1.5 锌通过竞争性吸收减少过渡金属诱导的氧化应激锌与过渡金属竞争性结合吸附位点,能够减少自由基的生成[14]。具有氧化还原活性的铁、铜离子与大分子物质(如DNA、蛋白质)结合会降低它们的化学反应电势,通过氧化还原循环反应将产生大量自由基[25]。此外,过渡金属与过氧化氢通过芬顿反应也能产生·OH,·OH具有较强的氧化性,能够引发脂质过氧化和蛋白质羰基化[14]。而锌与铁、铜配位化学性质相似,可竞争结合位点,减少自由基的产生,避免脂质双分子层受到破坏[25]。同时,研究发现二价金属锌转运体能够抑制铁的转运[14]。
1.6 锌对蛋白质疏基的保护作用 锌可通过与蛋白质疏基结合,发挥抗氧化作用。锌能通过与疏基接近的位点结合形成空间位阻,或与其他位点结合导致蛋白质构象发生变化,防止疏基被氧化进而起到对蛋白质的保护作用[25]。NO 等氧化剂可以导致锌从MT 或其他含锌蛋白中释放,同时对硫醇残基进行化学修饰,若被修饰的蛋白质参与信号传递(如转录因子、激酶、磷酸酶、微管蛋白等),则活性的变化将导致信号调节的变化。同时,锌本身可以调节转录因子或相关酶的活性,间接影响氧化还原信号传导。
综上所述,锌通过调节自由基的生成与猝灭、激活抗氧化酶活性、调节抗氧化蛋白的合成、竞争性结合吸附、保护蛋白质疏基等多种途径发挥抗氧化功能。
2.1 猪 近年来的研究表明,日粮中补充适量锌可提高仔猪抗氧化性能,改善机体免疫力,缓解断奶应激引起的仔猪腹泻。解玉怀等[26]研究发现,日粮添加25、50、75、100 mg/kg 大豆水解产物螯合锌组或硫酸锌组仔猪生长性能均高于对照组,饲喂补锌日粮10 d 后,仔猪肝脏Mn-SOD 活性、MT 含量及有机锌组仔猪十二指肠MT 含量均显著高于对照组。刘树全[27]研究发现,与饲喂基础日粮的对照组相比,日粮中添加50、100、200 mg/kg 甘氨酸锌(Zn-Gly)均可显著提高断奶仔猪血清Cu/Zn-SOD 活性,促进仔猪生长,其中100 mg/kg锌的改善效果最好。唐萍[28]的研究结果表明,与对照组相比,日粮中添加不同水平的蛋氨酸锌(Zn-Met)均可显著提高断奶后7 d 或14 d 仔猪血清Cu/Zn-SOD 活性及GSH-Px 活性。前期的研究结果表明补锌对猪的抗氧化性能具有改善效果,近年来也有一些研究主要侧重于不同锌源间抗氧化效果的比较。方洛云等[29]研究表明,添加100 mg/kg Zn-Met 较添加同剂量的ZnO 相比,断奶仔猪血清SOD 活性极显著提高了1.36 倍,肝脏SOD 活性提高了29.33%,同时,肝脏MT 含量增加了1.5倍。黄丹萍[30]研究发现,日粮中添加100 mg/kgZn-Gly 或Zn-Met 可缓解仔猪腹泻,改善机体抗氧化性能,表现为补锌组血清及肝脏NO 含量、丙二醛(MDA)含量显著降低,同时肝脏GSH-Px 活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著升高,其对仔猪抗氧化性能的改善效果优于同剂量ZnSO4。此外,研究表明高剂量ZnO 也具有改善仔猪抗氧化性能的效果。吕航等[31]研究发现,日粮中添加2250 mg/kg ZnO 饲喂断奶仔猪能够显著降低腹泻率,同时提高仔猪第14 天血浆T-SOD 和第28天血浆GSH-Px 活性。目前,关于高剂量ZnO 的改善效果是ZnO 分子态还是Zn2+态发挥作用目前尚不能确定,高剂量ZnO 缓解仔猪腹泻一方面可能与其具有的收敛黏附作用有关,另一方面药理剂量的ZnO 还可改善仔猪肠道细胞氧化还原状态,提高机体抗氧化能力,进而抑制肠道细胞凋亡、促进细胞增殖,增强肠道屏障的修复功能[32]。此外,高锌可能通过抑制有害菌的生长及其黏附作用发挥效应。
除在断奶仔猪中具有较好效果外,锌添加剂在母猪和生长育肥猪中也表现出较好功效。李文等[15]研究表明,饲喂添加不同锌源及水平(50 mg/kg ZnSO4、25 mg/kg ZnSO4+25 mg/kg Zn-Met、50 mg/kg ZnSO4+25 mg/kg Zn-Met、25 mg/kg ZnSO4+50 mg/kg Zn-Met 和100 mg/kg ZnSO4)的试验组日粮30 d 后,与对照组相比,母猪妊娠期第110 天的血清锌含量显著增加,血清GSH-Px、SOD 活性显著提高。自由基对生物膜中的不饱和脂肪酸的攻击会导致脂质过氧化的发生,进而引起细胞膜结构和功能发生改变,脂质过氧化物代谢终产物MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度[33],而试验结果也表明母猪血清中MDA 含量显著下降,且随着锌含量的升高及Zn-Met 的使用,抗氧化性能逐渐升高。同时,随着母猪妊娠后期在饲粮中补锌,哺乳期仔猪抗氧化性能也可得到一定程度改善[15]。胡雄贵等[34]的研究表明,外源添加氨基酸螯合锌可增加长白育肥猪血清及肌肉中锌的沉积效率,且肌肉和血清中GSH-Px、Cu/Zn-SOD、T-AOC 水平随氨基酸螯合锌添加量的增加而呈上升趋势。牛现琇等[35]研究发现,与对照组相比,日粮中分别添加40 mg/kg Zn-Met、40 mg/kg 和80 mg/kg ZnSO4可显著提高生长育肥猪血清GSH-Px、T-SOD、Cu/Zn-SOD 活性,显著降低MDA 含量。此外,添加40 mg/kg Zn-Met 组生长育肥猪血清MDA 含量最低,而血清GSH-Px、T-SOD 活性最高,表明不同锌源均有助于提高猪抗氧化能力,但氨基酸螯合锌效果优于无机锌,这可能与氨基酸螯合锌稳定的理化性质有关[36]。以上结果表明,适量补锌能够增强机体抗氧化能力,提高生产性能。
2.2 鸡 蛋鸡因长期脂质代谢旺盛容易造成体内ROS 等物质积累,产蛋期可通过补锌维持抗氧化系统的稳定进而改善机体状况。陈娜娜等[37]发现,在蛋鸡饲粮中添加70 mg/kg 或140 mg/kg Zn-Met 8 周后,其肝脏及血清Cu/Zn-SOD 活性和T-AOC 均可显著提高,且MDA含量显著下降;而当日粮中添加1 400 mg/kg Zn-Met 时,蛋鸡的抗氧化性能显著下降;根据二次曲线拟合分析得出日粮添加60~100 mg/kg Zn-Met 时,蛋鸡抗氧化性及免疫性能较好。Abedini 等[38]的试验结果也表明,饲粮补充80 mg/kg Nano-ZnO 或Zn-Met 可显著提高产蛋量,并可改善蛋品质,同时血清、肝脏、胰脏中的SOD 活性显著提高。王惠云等[39]报道,蛋鸡产蛋后期产蛋率、日产蛋重、蛋壳品质均与羟基蛋氨酸锌(MHA-Zn)的添加水平呈二次线性关系,以80 mg/kgMHA-Zn 替代基础日粮中70 mg/kg ZnSO4效果最好。刘凤霞等[40]研究结果表明,产蛋后期海兰灰蛋鸡抗氧化性能随着日粮锌含量的增加而得到不同程度提高,其中80 mg/kg MHA-Zn 组的蛋鸡抗氧化性能改善效果最佳,表现出Cu/Zn-SOD 在血清及肝脏中的活性显著升高,同时肝脏T-AOC 也得到显著提高,但生产性能未随着不同锌源及添加水平发生显著改变。张亚男等[41]研究表明,添加70 mg/kg ZnSO4对机体抗氧化性改善效果最佳,但添加不同水平及不同形式的锌对生产性能并未产生显著影响。试验蛋鸡品种、试验周期、饲养环境及基础日粮锌含量间的不同可能是造成以上差异的原因。虽然鸡对锌的耐受量较高,但高锌仍会对其产生毒性作用。杨自君等[42]研究表明,日粮添加1、2、4 g/kg 的锌会引起蛋鸡采食量及产蛋率明显下降,其中4 g/kg 锌处理组蛋鸡肝脏、肾脏等器官出现变性、坏死现象。因此,生产中应严格把控补锌剂量。
日粮补充锌也可提高肉鸡抗氧化功能。刘泽辉等[43]研究发现,添加60、120、180 mg/kg 的不同形态锌(无机锌源为ZnSO4,有机锌源分别为络合强度较弱的复合氨基酸锌C(Zn-AAC)、络合强度中等的锌蛋白盐B(Zn-Pro B)及络合强度较强的锌蛋白盐A(Zn-Pro A)均可显著提高肉雏鸡胸、腿肌及肝脏中Cu/Zn-SOD 与MT 的基因表达水平,肝脏、胸肌、腿肌Cu/Zn-SOD活力、MT 含量也得到显著提高,而肝脏MDA 含量显著降低。Akhavan-Salamat 等[44]等报道,将不同形式的锌(ZnO、Zn-Met、Nano-ZnO)分别以不同的剂量(20、40、80 mg/kg)添加至日粮中饲喂热应激肉鸡,结果表明,随着锌浓度的增加,SOD 活性有升高趋势,血清MDA浓度下降,且Zn-Met、Nano-ZnO 的抗氧化效果显著优于ZnO。吴量等[45]在研究等量Zn-Met 与ZnSO4对肉鸡性能影响的试验中也发现,40 mg/kg Zn-Met 可显著降低耗料增重比,同时显著提高21 日龄肉鸡血清Cu/Zn-SOD 活力,MDA 含量显著降低,Cu/Zn-SOD 在42日龄肉鸡血清中的活力及血清中的T-AOC 都得到显著提高。不同锌源的应用效果可能与这些补充剂中锌的生物利用度有关。赵润梅等[46]研究表明,锌源及添加锌水平均会对肉鸡日增重、耗料增重比产生影响,其中在1~6 周龄肉鸡日粮中补充60 mg/kg ZnSO4效果较好;不同锌水平日粮对肉鸡抗氧化力的改善效果不显著,不同锌源仅在21 日龄GSH-Px 活性方面存在差异,其中ZnSO4效果优于Zn-Met,造成这种结果可能与有机锌品质有关;其次,基础日粮中原料所含锌元素可能会满足雏鸡营养需求,因此额外补充锌尚未达到显著提高机体抗氧化性的效果。
锌元素对动物机体抗氧化作用的发挥具有重要作用,其可以通过自由基猝灭、抑制NADPH 氧化酶活性、激活抗氧化酶活性、调控锌代谢相关蛋白、竞争性结合吸附、半胱氨酸代谢调控、保护蛋白质疏基等多种途径发挥抗氧化功能,但不同剂量、不同锌源对动物机体的抗氧化应激功效存在差异,这在动物实际生产中应予以关注,且动物在不同应激状态下锌元素的抗氧化效应也值得深入探讨。