miR-122-5p通过ADAM10基因抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移的研究

徐兴远，龙晶，张祯晶

（1.中南大学湘雅医院 妇产科，湖南 长沙 410008；2.中南大学医学院 临床医学系，湖南 长沙 410008）

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，5 年生存率低于45%［1］。在卵巢癌早期，患者并无明显症状。当癌症进一步进展，相关症状才逐一显出［2］。尽管有手术治疗及放化疗等手段，卵巢癌的预后仍不容乐观。故此，寻找卵巢癌预防及治疗的方法迫在眉睫。

微小核糖核酸（micro ribonucleic acid,miRNA）是一类单链非编码核糖核酸，长度在18～24 个核苷酸之间。它们通过与信使核糖核酸（mRNA）的3'未翻译区（3'untranslated region,3'UTR）序列特异性结合，来对mRNA 进行转录后的负向调节，进而在诸多生物进程中起到关键作用［3］。

一方面，微小核糖核酸122-5p（microRNA-122-5p,miR-122-5p）是脊椎类物种的特定miRNA，它与许多恶性肿瘤如胃癌［4-5］、乳腺癌［6］等存在关联。另一方面，ADAM10 基因被证明参与了调节细胞表面蛋白功能的过程，它与参与肿瘤进展的诸多因子如表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、钙黏附蛋白E（E-cadherin）和炎症因子等相关［7］。

该研究阐明了miR-122-5p 在卵巢癌细胞增殖、转移及凋亡中的作用，并进一步证明了miR-122-5p是通过与ADAM10 基因的mRNA 直接作用来调节细胞功能的。综合而言，该研究证实miR-122-5p可以作为肿瘤抑制因子，有望成为未来的卵巢癌治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

卵巢癌细胞系A2780 和SKOV3 购买于中科院生化细胞实验室（中国，上海）。培养液采用DMED 培养液加10% 胎牛血清（FBS）（购于Invitrogen 公司，美国），抗生素选用100 u/mL 的青霉素和100 μg/mL 的链霉素（购于Hyclone 公司，美国），细胞培养条件为37℃、5%二氧化碳的温箱。卵巢癌耐药株A2780/DDP 为自己培育，保存于最终浓度为1 μg/L 的顺铂溶液中，方法参见文献［6］。

1.2 RNA 提取及实时定量聚合酶链式反应

应用TRIzol 试剂（购于Invitrogen 公司，美国）根据标准流程提取RNA。关于ADAM10 的表达设计，通过第一链合成系统（Superscript First-Strand Synthesis System）（Invitrogen 公司）设计。应用的引物如下：正向引物5'-GCAATACTCGCCT TACGGCT-3'，反向引物5'-TACACACCTTGGTAGT ACGCC-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。其中GAPDH 作为对照。miR-122-5p 定量检测通过TaqMan miRNA Assay（ABI 公司）按标准流程完成。U6 snRNA 作为内对照。实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）完成于ABI 7900HT 仪器。所有的试验均独立完成3 次。

1.3 质粒和慢病毒的构建

MiR-122-5p 过表达载体通过如下引物构建：正向引物5'-AAAGGATCCCAGGAGTTGTAAATCCG AGCCG-3'，反向引物5'-AAAGAATTCTTCATAGGT CAGAGCCCTGTGCA-3'，方法见文献［6］。编码ADAM10 蛋白的DNA 片段先经PCR 扩增再载入pcDNA3，1 载体（Clontech,Palo Alto，美国），应用的引物如下：正向引物5'-AAAGCTAGCATGTTA GGAACTGTGAAGATGGAAG-3'，反向引物 5'-AAACTCGAGCTAGGAAGTGTTTAGGACGGGTCT-3'。Mir-122-5p 慢病毒通过用pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（美国SBI 公司）共转染HEK293T获得，见文献［6］。为产生稳定的细胞株，细胞转染慢病毒24 h，并更换完全培养液。转染后96 h，用qRT-PCR 确认转染效率。

1.4 荧光素酶活性试验

含野生型或突变型ADAM10 基因的荧光素酶报告基因载体，与含miR-122-5p 的HEK293T 细胞共转染。转染后48 h 洗脱、裂解并通过双重荧光酶报告试剂（Promega,Madison，美国）按标准流程分析。

1.5 细胞活性、集落形成和细胞凋亡的测定

细胞活性通过细胞计数盒CCK8 计算。细胞种于96 孔板，1×103细胞/孔，容量100 μL 培养液。每孔加入10 μL CCK 试剂，分光光度计于450 nm 波长测定光密度（optical density,OD）值。

集落形成试验。细胞种于6 孔板，800 细胞/孔，孵育14 d。之后每3 日更换含10%FBS 的培养液，观察生成的细胞集落。超过40 个细胞的集落计算在内，观察四个象限，并计算平均值。另外，水晶紫染色后拍照以便展示。

细胞凋亡通过凋亡检测盒完成［Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit（Millipore，美国）］。细胞标本收集后，用5 μL 膜连蛋白V-PE 和5μL PI 染色。通过流式细胞学检测细胞的凋亡，结果通过Cell-QuestTM Pro 软件分析。收集预处理的细胞，于70%浓度的乙醇在4℃过夜，后悬浮于1 mL 含1 mg/mL RNase（Sigma,St.Louis，美国）和50 μg/mL PI 试剂的PBS 溶液中，室温暗箱孵育30 min。

1.6 细胞迁移和侵袭试验

细胞迁移和侵袭能力测定采用标准的Transwell 试验。将3×104细胞置于100 μL 无血清培养液内，加入试验板的上层。600 μL 含10%FBS培养液置于下层。分别于12 或36 h 后，细胞固定并用0.05%水晶紫染色计数。显微镜下200 倍拍照以便展示。

1.7 Western Blot

细胞收集后裂解，共分离出60 μg 蛋白，置于10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜。用1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）于TBST 缓冲液中室温孵育1 h 封闭。加入ADAM10、BCL-2 及Cyclin D1 蛋白的抗体，和GAPDH 于4℃过夜。洗膜，加入羊抗兔、辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1 h。蛋白条带通过增强化学荧光试剂ECL（Millipore,MA，美国） 检测，并通过图像J（Image J）软件分析。

1.8 统计学方法

所有的统计学数据应用SPSS 19，0 软件进行分析计算。计量资料以均数±标准差（）表示，应用t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-122-5p 抑制卵巢癌细胞体外增殖

将卵巢癌细胞系SKOV3 和A2780 转染miR-122-5p，或转染空白载体作为各自对照组，并通过qRT-PCR 证实成功转染的效果（P＜0.01），见图1。此后，评估转染后细胞的活性和增殖能力。结果表明，转染3 日后，与对照组相比，转染了miR-122-5p 的SKOV3 和A2780 细胞的活性明显降低（P＜0.01），见图2；另外，细胞集落形成能力也大大降低了，见图3。总体上，这些结果证明了miR-122-5p 抑制卵巢癌细胞的体外增殖。

图1 SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 的情况

图2 SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后活性的变化

图3 SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后形成集落能力的变化

2.2 miR-122-5p 诱导卵巢癌细胞凋亡

上述证明了miR-122-5p 抑制卵巢癌细胞增殖，针对此点深入研究，阐述miR-122-5p 对卵巢癌细胞凋亡过程的影响。以转染空白载体作为对照组，转染miR-122-5p 后，SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞的凋亡率明显增加（P＜0.01），见图4。并且，转染miR-122-5p 后的SKOV3 和A2780 细胞较对照组有更高的Bax 表达和更低的BCL-2 及Cyclin D1表达，见图5。其中，Bax 是凋亡起始的重要蛋白，BCL-2 抑制细胞凋亡，Cyclin D1 促进细胞周期进展。

图4 SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后的凋亡率变化

图5 SKOV3 和A2780 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后Bax、BCL-2 及Cyclin D1 表达的变化

2.3 miR-122-5p 抑制卵巢癌细胞的体外侵袭转移能力

细胞增殖能力是评估肿瘤恶性程度的重要指标，但仍不全面，因为仍需考虑到肿瘤细胞的侵袭和转移能力。试验结果证明，以转染空白载体作为对照组，转染miR-122-5p 后的SKOV3 细胞和A2780 细胞的侵袭转移能力均大幅下降（P＜0.01），见图6。

图6 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后侵袭及迁移能力的改变

2.4 ADAM10 是miR-122-5p 的直接靶基因

上述已阐明了miR-122-5p 能抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭转移，仍需进一步寻找其作用靶点。该研究通过TargetScan 工具寻找到ADAM10 的3'UTR 可能是miR-122-5p 的作用位点。同时设计出该结合位点的突变体结构，见图7，后文中分别以野生型ADAM10 和突变型ADAM10 来区分。试验采用SKOV3 卵巢癌细胞，分为转染miR-122-5p组和转染空白载体的对照组，此外每组细胞亦转染野生型ADAM10 或突变型ADAM10 基因，应用荧光素酶检测方法判定miR-122-5p 对ADAM10 基因表达的调控作用。结果表明，在转染野生型ADAM10 基因的SKOV3 卵巢癌细胞中，共转染miR-122-5p 的细胞相比于对照组具有明显降低的荧光素酶活性（P＜0.01）；另一方面，在转染突变型ADAM10 基因的SKOV3 卵巢癌细胞中，共转染miR-122-5p 的细胞与对照组相比，荧光素酶活性无明显差异，见图8。

图7 miR-122-5p 的靶基因预测

图8 共转染miR-122-5p 及野生型或突变型ADAM10基因后卵巢癌细胞的荧光素酶活性比较

进一步测定ADAM10 基因在转染miR-122-5p后的表达情况的变化。同样以转染空白载体作为对照组，两种细胞系SKOV3 和A2780 在转染miR-122-5p 后，较对照组细胞ADAM10 mRNA 水平均明显下降（二者均P＜0.01），见图9，翻译的蛋白量亦明显下降（二者均P＜0.01），见图10。上述结果表明miR-122-5p 直接作用于ADAM10 基因并抑制其表达。

2.5 miR-122-5p 调节卵巢细胞于体外对顺铂的敏感性

接下来评估卵巢癌细胞miR-122-5p 表达水平与其化疗敏感性的关系。试验采用顺铂耐药卵巢癌细胞株A2780/DDP，对照组为普通的顺铂敏感的A2780 细胞株。结果表明，相比于对照组，A2780/DDP 细胞的miR-122-5p 表达水平明显下降（P＜0.01），见图11。进一步将耐药株A2780/DDP转染miR-122-5p，并以转染空白载体为对照组，通过qRT-PCR 验证顺铂耐药株A2780/DDP 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 成功（P＜0.01），见图12A。此后发现，耐药株A2780/DDP 转染miR-122-5p后，相比与对照组，其顺铂的半数抑制浓度（inhibitory concentration 50,IC50）明显下降（P＜0.01），见图12B。最后，试验表明了A2780/DDP 转染miR-122-5p 后，比对照组细胞的凋亡率明显上升（P＜0.01），见图12C。综合起来，这些结果阐明了增加miR-122-5p 的表达会提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

图9 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后ADAM10 mRNA含量的变化

图10 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后ADAM10 基因表达蛋白含量下降

图11 普通细胞株A2780 和耐药株A2780/DDP 卵巢癌细胞所含miR-122-5p 表达量区别

图12 卵巢癌细胞转染miR-122-5p 后对顺铂的敏感性

3 讨论

miR-122-5p 作用广泛，目前已证明其在急性心肌损伤［8］、肝损伤［9］及鼠骨间充质干细胞分化中起到重要作用［10］。它还与脂肪肝和脂蛋白代谢有关［11］，白介素22 介导miR-122-5p 促进角蛋白形成细胞的增殖［12］。同样地，很多研究表明miR-122-5p 与恶性肿瘤相关，如胃癌［4-5］、乳腺癌［6］等。故该研究旨在发现miR-122-5p 对卵巢癌的作用及机制。

该研究证明了miR-122-5p 通过负向调节ADAM10 基因的表达，能抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移。这与其他研究中miR-122-5p 与ADAM10基因对肿瘤细胞起到的作用相一致。比如上述提到的，胃癌中过表达miR-122-5p 与更小的肿瘤体积和更早的肿瘤分期是正相关的［4］。又如有研究发现沉默ADAM10 基因对胰腺癌细胞的活性无明显影响，但明显降低了癌细胞侵袭和转移的能力［13］。

顺铂耐药是临床进展期卵巢癌化疗面临的首要困难之一，诸多试验从各种方向尝试解决化疗耐药问题，可惜的是目前仍无较好的办法［14-15］。该研究尝试从miRNA 角度探讨其与化疗耐药的关联。幸运的是研究证明了顺铂耐药细胞株A2780/DDP 有较低的miR-122-5p 表达水平，过表达miR-122-5p 可以增加耐药株A2780/DDP 的凋亡率，并降低顺铂的半数抑制量（IC50）。为进一步研究卵巢癌化疗耐药机制及解决办法提供一些思路。

然而该试验仍有可以继续完善之处。首先，该研究仅仅停留在分子生物学和细胞学试验层面，动物学试验有待进一步开展。动物学试验的结果，是指导该研究成果转化为临床应用手段的不可或缺的基础。这一点对于miR-122-5p 能否帮助解决临床上卵巢癌铂类耐药的问题尤为重要。而且在体内试验中印证miR-122-5p 有效性的同时，也有机会观察其安全性。因为miRNA 在体内作用广泛，并非仅针对肿瘤细胞，故在明确miR-122-5p 对肿瘤作用的同时，也需要重视过表达miR-122-5p 是否会对机体产生明显的副作用。这可以在动物实验中进行初步观察和判断。比如荷瘤动物在引入过表达miR-122-5p后，是否出现体重下降更快或生存时间更短的现象。

此外，miR-122-5p 在卵巢癌流行病学中的作用需要进一步阐明。若能充分结合临床数据，阐述miR-122-5p 与患者癌症分期、预后、化疗敏感性以及肿瘤复发等方面的相关性，将能在后续试验中更加有方向性的深入研究miR-122-5p 对卵巢癌的作用及相关机制。

综上所述，本研究阐述了miR-122-5p 作为肿瘤抑制因子起作用，可以抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移，并能降低其对顺铂的耐药性。这可能成为未来治疗卵巢癌的靶点。后续试验仍有待进一步开展。