水提醇沉法提取蛹虫草多糖的工艺优化及体外抗氧化效果研究

师景双，袁 超，程月红，厉玉婷，李 静，任雪梅*

（1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东济南 250101）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北蛹虫草、北虫草[1]。蛹虫草含虫草多糖、虫草酸、虫草素、黄酮及甾醇等多种活性成分[2-3]。蛹虫草多糖具有抗氧化、免疫调节和抑制肿瘤细胞生长等诸多生理功能[4-6]。本文对蛹虫草多糖提取工艺进行优化，并对其体外抗氧化活性进行了研究，以期为蛹虫草多糖的开发研究提供参考和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MS204TS分析天平（梅特勒-托利多）；SHA-B水浴恒温振荡器（金坛医疗仪器厂）；TG16-WS离心机（万丰仪器制造公司）；UV-2700紫外可见分光光度计（日本岛津）；R-300旋转蒸发仪（瑞士步琦公司）。

1.2 材料与试剂

人工蛹虫草（市售）；KH2PO4，FeSO4，FeCl3，铁氰化钾，水杨酸，双氧水，抗坏血酸，三氯乙酸，95 %乙醇，无水乙醇，葡萄糖，硫酸，蒽酮（分析纯，国药集团）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海阿拉丁）；蒽酮试剂：精密称取蒽酮0.1 g，加80 %浓硫酸100 ml溶解，摇匀，当日配制使用。

2 方法

2.1 葡萄糖对照品溶液配制

将无水葡萄糖置于烘箱中，105 ℃干燥恒重。准确称取100 mg，用蒸馏水定容至100 ml，得对照品母液。取10 ml母液定容至100 ml，得0.1 mg/ml葡萄糖对照品溶液。

2.2 提取工艺

将蛹虫草粉碎过筛，取筛下物，加热水提取，提取完毕后收集滤液，残渣再次提取30 min，合并滤液，真空浓缩至固形物含量25 %～30 %后，加入3倍体积95 %乙醇沉淀多糖，4 ℃静置24 h，5000 r/min离心15 min，无水乙醇洗脱，冷冻干燥，得蛹虫草多糖。

2.3 虫草多糖的测定

分别吸取0.1 mg/ml葡萄糖对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，置于10 ml具塞比色管中，补充水至2.0 ml，加入蒽酮硫酸溶液6.0 ml，混匀，置沸水浴中加热15 min，取出，立即置于冰浴中冷却15 min，取出，空白管调零，625 nm测定吸光度[7]，绘制标准曲线。

将粗多糖用蒸馏水溶解，定容于100 ml 量瓶，摇匀，得待测母液。将待测母液进行适宜倍数稀释，取稀释液1 ml，置于10 ml具塞比色管中，采用与标准曲线相同的操作步骤测定，按标准曲线计算多糖含量，按下式计算多糖提取率。

多糖提取率（%）=测得的多糖含量×稀释倍数/蛹虫草菌粉质量×100

2.4 单因素实验

选取菌粉粒度、料液比、提取温度、提取时间、提取次数5因素进行单因素实验，初步选定菌粉粒度80目、料液比1：15、提取温度70 ℃、提取时间2 h及提取次数1次为基本条件，改变其中一个条件，固定其他条件来考察各因素对蛹虫草多糖提取率的影响，以确定较优条件。其中菌粉粒度分别设为40，60，80，100目，料液比分别设为1：10，1：15，1：20，1：25，提取温度分别设为50，60，70，80 ℃，提取次数分别设为1，2，3，4次。

2.5 正交试验

根据单因素实验结果，对料液比、提取温度、提取时间、提取次数这4个因素进行4因素3水平的正交实验，进一步优化提取条件，并根据正交试验得出的优化条件进行验证实验。

2.6 体外抗氧化效果测定

2.6.1 蛹虫草多糖清除DPPH 自由基效果检测DPPH乙醇溶液本身为紫色，且在517 nm波长处有强烈吸收，加入抗氧化剂后其颜色变浅，以在517 nm波长处吸光度的下降值表示抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力[8-9]。参考李志平等[10]的方法，略作改动，于具塞试管中加入 DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/l）1 ml，分别加入不同浓度的样品溶液1 ml，混匀，室温下避光静置30 min，517 nm处测定吸光度值，同时选取抗坏血酸为作为阳性对照，DPPH自由基的清除率按以下公式计算。

式中，A0为空白样品吸光度值，A1为加样后的吸光度值，A2为以蒸馏水代替DPPH的吸光度值。

2.6.2 蛹虫草多糖清除羟自由基效果测定 羟自由基是机体代谢产物，是机体内起主要作用的自由基之一。参考邵双双等[11]的方法，向2 ml不同浓度的样品溶液中加入6mmol/L FeSO4溶液2 ml，混匀后加入6 mmol/L H2O2溶液2 ml，摇匀，静置10 min，加入6 mmol/L水杨酸2 ml，混匀后再次静置10 min，于510 nm 处测定吸光度值。同时选取抗坏血酸为作为阳性对照，按下式计算羟自由基的清除率。

式中，A0为空白样品吸光度值，A1为加样后吸光度值，A2为以蒸馏水代替H2O2溶液的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程为A=0.0044C+0.0127，相关系数R2=0.9998。

3.2 单因素实验

3.2.1 菌粉粒度对蛹虫草多糖提取率的影响 结果见图1。原料粒度的大小决定原料的表面积，进而影响与溶剂的接触和传质过程，原料直径愈小，溶剂与原料接触愈充分，提取速度也就愈快。由图1可见，菌粉粒度从40目到80目变化过程中，蛹虫草多糖的提取率呈明显上升趋势，从80目到100目多糖提取率开始呈现缓慢下降趋势，分析原因为：80目筛下物已完全达到蛹虫草多糖提取所需的破碎程度，随着破碎程度的增大，100目筛下物提取完毕后过滤阻力明显增大，蛹虫草粉压实引起小部分多糖损失故多糖提取率开始呈下降趋势，因此80目为蛹虫草多糖提取的较优菌粉粒度。

图1 菌粉粒度对提取率的影响

3.2.2 料液比对蛹虫草多糖提取率的影响 结果见图2。料液比增大，可降低菌粉颗粒周围多糖的浓度，增大细胞内、外的渗透压差，有利于蛹虫草多糖的进一步溶出。因此，实际生产中通常可考虑加大提取溶液的用量来获得较高的提取率。由图2可见，料液比从1：10提高至1：20的过程中，蛹虫草多糖提取率的增大趋势显著，继续提高料液比，提取率增大趋势不再明显。且过高的料液比会对后期的浓缩工序造成压力，综合考虑生产周期及经济成本等因素，一味通过提高料液比来增大提取率是不可取的，因此1：20为蛹虫草多糖提取的较优料液比。

图2 料液比例对提取率的影响

3.2.3 提取温度对蛹虫草多糖提取率的影响 结果见图3。随着水浴温度的升高，分子热运动加快，细胞内容物的穿透力增强，蛹虫草多糖得率亦随之增加。由图3可见，温度从50 ℃上升至70 ℃过程中，多糖提取率呈直线上升趋势，70 ℃后增加趋势开始较缓慢，这是由于蛹虫草多糖是活性物质，温度过高易造成其结构破坏，进而影响其生物活性。因此综合考虑70 ℃为蛹虫草多糖的较优提取温度。

图3 提取温度对提取率的影响

3.2.4 提取时间对蛹虫草多糖提取率的影响 结果见图4。提取时间可直接影响蛹虫草多糖的溶出，理论上讲，时间越长，越有利于蛹虫草多糖的溶出，但随着提取时间的延长，细胞内、外渗透压逐渐趋于平衡，多糖进入水溶液中的推动力也在逐渐下降，长时间的热提取也会造成一部分蛹虫草多糖的降解。由图4可见，当提取时间达到2 h时，多糖的提取率达峰值，2 h后多糖的提取率开始呈下降趋势，综合考虑能源损耗和节成本，2 h为蛹虫草多糖的较优提取时间。

图4 提取时间对提取率的影响

3.2.5 提取次数对蛹虫草多糖提取率的影响 结果见图5。长时间的单次提取，不仅会造成多糖溶出效率降低，且提取出来的多糖还会发生部分降解。所以实验设计多次提取方案，一次提取之后，将残渣加入5倍菌粉的蒸馏水，分别进行2次、3次、4次提取。由图5可见，3次提取后多糖的提取率基本不再发生变化，说明多糖已提取完全。故3次提取为蛹虫草多糖的较优提取次数。

图5 提取次数对提取率的影响

3.3 正交试验

在单因素实验基础上，采用L9（34）正交试验对料液比例、提取温度、提取时间、提取次数这4个因素条件进行优化，因素水平表的设置见表1。

表1 正交试验因素水平表

根据表1的设计进行正交实验，结果见表2。

表2 正交试验结果

由正交试验结果可知，各因素对多糖提取率影响的主次顺序为A＞D＞B＞C，即料液比＞提取次数＞提取温度＞提取时间；最佳提取条件为A2B1C2D3，即料液比1：20、提取温度65 ℃、提取时间2 h、提取次数3次。在此条件下多糖提取率为10.42 %，与正交实验最优组（第4组）相符。

3.4 体外抗氧化活性测定

3.4.1 DPPH自由基清除能力测定 结果见图6。由图6可见，随着多糖和抗坏血酸浓度的增加，DPPH自由基的清除率呈上升趋势，同浓度下抗坏血酸清除DPPH 自由基的能力更强；随着浓度的增加，二者清除DPPH自由基能力的差距逐渐减小，当浓度为1.2 mg/ml时，多糖对DPPH自由基的清除率为50.28 %，为同浓度下抗坏血酸的54.29 %。

图6 多糖与抗坏血酸清除DPPH自由基效果

3.4.2 羟自由基清除能力 结果见图7。由图7可见，随着多糖和抗坏血酸浓度的增加，羟自由基的清除率呈上升趋势，当多糖浓度在0.2～1.0 mg/ml范围内时，清除率增速明显，同浓度下抗坏血酸清除羟自由基的能力更强；随着浓度的增加，二者清除羟自由基能力的差距在逐渐减小，当浓度为1.2 mg/ml时，多糖对羟自由基的清除率为60.29 %，为同浓度下抗坏血酸的65.69 %。

图7 多糖与抗坏血酸清除羟自由基效果

4 结论

采用水提醇沉法提取蛹虫草多糖，通过单因素实验、正交试验优化提取工艺，得出最佳提取条件为菌粉粒度80目、料液比1：20、提取温度65 ℃、提取时间2 h、提取次数3次，在此条件下，提取率达10.42 %。DPPH自由基和羟自由基清除能力反应了多糖的抗氧化活性，在一定浓度范围内，随着浓度的增加，DPPH自由基和羟自由基的清除率呈上升趋势，即多糖的抗氧化活性随浓度的增大不断增强。虽然同浓度下抗坏血酸的清除能力比多糖强，但是随着浓度的增加二者的差距在不断减小，当浓度为1.2 mg/ml时，多糖对DPPH自由基、羟自由基的清除率分别为50.28 %，60.29 %，为同浓度下抗坏血酸的54.29 %，65.69 %。

陈安徽等[12]的研究表明，采用80 ℃一次提取，蛹虫草多糖的提取率为9.31 %，对提取的多糖进行清除DPPH自由基清除能力检测，结果显示当多糖浓度为1.2 mg/ml时，清除率为29.45 %。本研究采用较低的水解温度，进行分次提取，不仅提高了多糖的提取率，且更好地保留了其抗氧化活性，为蛹虫草多糖的开发利用奠定了一定的基础。