UV+ARTP复合诱变筛选MK-7高产菌株的研究

任 明，孙 荣，刘建民

（山东惠仕莱生物科技有限公司，山东 济南 250101）

甲萘醌-7（MK-7）是生物活性最高的一种维生素K2，可通过调节体内钙离子沉积，促进骨组织内骨钙素的合成，预防和治疗骨质疏松症[1]。天然MK-7仅能通过微生物发酵法获得[2]，其中，纳豆芽孢杆菌生长速度快、易于培养、MK-7含量相对高，是目前进行工业化生产MK-7的主要微生物。但野生型的纳豆芽孢杆菌的MK-7产量不能满足工业化生产的要求，需通过诱变育种获得目的产物产量更高的突变株。

目前，紫外诱变（UV）仍是实验室最常用的菌种诱变方法，但长时期采用单一诱变会导致菌种产生疲劳效应，还会因为反复诱变处理使得生物量降低、产物含量减少。因此，多种方式复合诱变提高诱变效果和产量是近年的研究热点。常压室温等离子体诱变（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）是利用在大气压下产生的，温度在25～40 ℃之间，具有高活性粒子浓度的等离子体射流进行诱变的新技术[3]。与传统诱变方法相比，ARTP对遗传物质的损伤机制多样，突变型多样。ARTP 生物育种技术以其操作便捷性、安全性和高效性等特点得到了广泛应用，在微生物育种领域发挥着重要作用[4]。ARTP已应用于包括细菌、真菌、放线菌、酵母、微藻等在内的40余种微生物的诱变育种[5]。

本文采用UV和ARTP对纳豆芽孢杆菌进行复合诱变（UV+ARTP），旨在筛选得到MK-7产量高的突变菌株，并对突变菌株的遗传稳定性进行研究，为该菌株应用于产业化生产打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ARTP-M 型常压室温等离子体诱变育种仪（无锡源清天木生物）； LC-20AT高效液相色谱系统（包括SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，7725i手动进样器，LC-solution色谱工作站管理软件，超声波脱气装置等，日本岛津）；旋转蒸发仪（巩义予华）；PHS-3C型酸度计（上海雷磁）；分析天平（北京赛多利斯）。

1.2 试剂

MK-7对照品（Sigma）；重蒸水；甲醇（色谱纯，TEDIA），其他试剂均为分析纯。

1.3 菌株

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），由实验室分离并保存。

1.4 培养基

斜面培养基：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 10 g/L，KH2PO45 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖 60 g/L，高温豆饼粉 30 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉 10 g/L，K2HPO4·3H2O 0.1 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 3 g/L，pH 7.0～7.2，115 ℃灭菌20 min。

2 方法

2.1 诱变方法

2.1.1 紫外诱变 取一只37 ℃培养18 h的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌体，180 r/min振荡60 min 使其充分打散，梯度稀释至菌浓度107～108个/ml。取菌悬液5 ml，置于灭菌的直径9 cm的平皿中，磁力搅拌作用下，在距18 W 紫外灯30 cm处进行不同时间的照射处理，诱变时间分别设定为30，60，90，120，150，180，210，240 s。于红光下分别进行梯度稀释，至菌浓度103～104个/ml，取0.1 ml 稀释液涂布种子培养基平板，37 ℃倒置培养24 h。通过平板菌落计数计算致死率，选择合适的紫外诱变时间。致死率（%）=（对照高于各诱变时间的菌落数/对照菌落数）× 100 %。

2.1.2 ARTP 取一只37 ℃培养18 h的新鲜斜面，用无菌水洗下菌体，180 r/min振荡15 min 使其充分打散，8000 r/min离心5 min收集菌体，以5 %甘油重悬，调整菌浓度107～108个/ml。开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30 min。灭菌结束后取10 μl 菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为10，20，30，40，50，60 s。每次诱变结束后均将载片置于含990 μl无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1 min。稀释涂布后置于37 ℃培养箱内培养24 h[6]。通过平板菌落计数计算致死率，选择合适的ARTP处理时间。致死率（%） =（对照高于各诱变时间的菌落数/对照菌落数）× 100 %。

2.1.3 复合诱变 按2.1.1、2.1.2项方法，将菌悬液紫外诱变150 s后，8000 r/min离心3 min，收集菌体，用5 %甘油重悬菌体，开启ARTP 系统对其诱变处理30 s[7]。诱变结束后将载片置于含990 μl 无菌生理盐水的EP 管中，漩涡震荡1 min后稀释至10-3，10-4，10-53个稀释度，涂布种子培养基固体平板，37 ℃培养48 h。从培养好的平板上挑取长势良好的单菌落进行发酵培养，测定MK-7的产量。

2.2 培养方法

2.2.1 种子培养 于新鲜斜面上取1环菌体，接种于种子培养基，37 ℃、180 r/min培养18 h。

2.2.2 发酵培养 按5 %的接种量将种子培养液接种于发酵培养基，37 ℃、80 r/min培养120 h。

2.3 分析方法

2.3.1 样品处理 取10 ml发酵液，加入正己烷-异丙醇（2：1，v：v）30 ml萃取，于恒温振荡器上240 r/min强力震荡15 min，静置5 min，收集上清。将下层溶液重复萃取一次，合并2次上清，45 ℃减压旋转蒸发，蒸干后加入5 ml乙腈洗蒸馏瓶，经0.45 μm有机滤膜过滤，待高效液相色谱（HPLC）检测[8-10]。

2.3.2 液相色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇；流速：1.5 ml/min；柱温：50 ℃；紫外吸收波长：270 nm。

3 结果与分析

3.1 MK-7的HPLC测定标准曲线建立

用乙腈配置不同浓度的MK-7对照品溶液，按2.3.2项色谱条件进样测定，制作标准曲线，以峰面积Y对浓度X（mg/L）进行线性回归，得回归方程：Y=8876.19X-28 403.3(R2=0.9987)，线性范围：0.1～100 mg/L，MK-7的保留时间为38.7～38.9 min，与其他组分分离良好。对照品和供试品的HPLC图谱见图1、图2。

图1 MK-7对照品HPLC图谱

图2 发酵提取液HPLC图谱

3.2 UV+ARTP复合诱变实验结果

3.2.1 紫外诱变 不同照射时间下的致死率结果见表1。随着照射时间的延长，菌株发生突变的可能性加大，与此同时菌株的致死率也在不断上升，突变的优良菌株也有可能因此致死，为得到有利于生产应用的正突变型菌株，我们选择致死率80 %～85 %的照射时间为紫外诱变的剂量，即采用18 W的紫外灯，垂直距离30 cm处，照射150 s。

表1 不同紫外线照射时间的致死率

3.2.2 ARTP处理 不同处理时间的致死率结果见表2。随着处理时间的延长，菌株的致死率不断升高，我们选择致死率80 %～85 %的处理时间定为ARTP的诱变剂量，故诱变时间确定为30 s。

表2 不同ARTP 处理时间的致死率

3.2.3 UV+ARTP复合诱变 通过UV+ARTP复合诱变，从固体培养基平板上共挑选出77个单菌落，分别进行摇瓶培养，验证突变株的MK-7产量。筛选得到了正突变株12株，正突变率为15.6 %。其中突变株UA31#产量最高，达20.5 mg/L，选择UA31#作为后续研究对象。

表3 菌株UA31#遗传稳定性结果

3.3 菌株UA31#遗传稳定性

将突变菌株UA31#连续12次传代培养，测定MK-7产量，以评价其遗传稳定性。以未经传代的诱变菌株的MK-7产量为基准，计算变化率。结果见表3。由表3可见，菌株UA31#各代的MK-7产量基本维持在20 mg/L左右，变化率在±5 %范围内，表明其遗传稳定性较好。

4 讨论

目前国内对MK-7的研究多集中于菌种发酵优化和产物提取检测方面，微生物诱变育种的报道不多。檀沐等[11]利用亚硝基胍（NTG）和低能氮离子束（N+）注入复合诱变的方法处理产MK-7的黄色短杆菌，获得的突变株产量为6.12 mg/L，较出发菌株提高了159 %。许静[12]采用UV和NTG相结合的方法对枯草芽孢杆菌进行诱变，获得突变株产量为19.85 mg/L，较出发菌株提高了90.5 %。宋均营等[13]利用NTG和N+注入复合诱变选育突变株，获得的突变株MK-7的产量为2.32 mg/L左右，比原始菌株提高了166 %。

本文首次采用UV+ARTP复合诱变技术筛选高产MK-7的菌株，选育出的突变菌株UA31#摇瓶单位比出发菌株提高了162.8 %，达20.5 mg/L，经连续传代12次遗传稳定性良好。本研究结果表明，UV+ARTP复合诱变是一种获得MK-7高产菌株的理想手段。当然，诱变育种只是提高菌株生产MK-7的基础产量，若要全面提高菌株的发酵水平，还要从培养基配方和发酵工艺的优化等方面着手，并通过小试中试逐级放大，使之适用于工业化生产。