救必应化学成分的分离与鉴定

陈曼钿，柳新然，张 琳，李 玲，李百柠，陈丽亚，陈 苗，陈 刚，李 宁

（沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016）

救必应（Ilex rotundaThunb.）又称山冬青、熊胆木、白木香等，为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属植物铁冬青的干燥树皮或根皮。广泛分布于东亚地区（中国、日本、韩国及越南等）[1]，在我国主要分布于安徽、江苏、福建、广东、广西、云南、台湾等地[2]，为华南地区常用中草药。救必应味苦，性寒，归肺、肝、大肠经，有泻火解毒、清热利湿、行气止痛、凉血止血等功效，民间主要用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、暑湿泄泻、急性胃肠炎，风湿痹痛等；外用治跌打损伤、烧烫伤、痈疖疮疡、外伤出血等[3]。因其治疗跌打损伤、烧烫伤的效果显著，故美其名为救必应[4]。现代药理学研究表明，救必应具有抗心律失常、降低冠脉流量、提高耐缺氧能力、降压、止血、抗炎、抑菌及抗肿瘤等药理作用。临床上救必应常应用于治疗胃肠道消化系统疾病、心血管疾病、以及多种感染性疾病[5]。本实验对救必应95 %乙醇提取物的乙酸乙酯层的化学成分进行分离与纯化，并根据理化性质、波谱数据鉴定化合物结构。共分离得到6个化合物，分别鉴定为3, 4-dihydroxy-acetophenone（1）、threo-8S-7-methoxysyringylglycerol（2）、2, 3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)-1-propanone（3）、caffeic acid (1-hydroxyl-4-O-β-D-glucopyranosylprenyl)-ester（4）、长梗冬青苷（pedunculoside，5）、rotungenoside（6）、救必应酸（rotundic acid，7）、rotungenic acid（8），其中化合物1～4为首次从冬青属植物分得。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Bruker-ARX-400型，Bruker-AV-600型核磁共振波谱仪（TMS内标，瑞士Bruker）；microTOFQ Bruker质谱仪（瑞士Bruker）；Shimadzu LC-6AD 高效液相色谱仪（SPD-20A UV-VIS型紫外检测器，RID-10A型示差检测器，日本Shimadzu公司）。分析型色谱柱：Unitary C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；YMC C18（10 mm×250 mm，5 μm）半制备型色谱柱；YMC C18（20 mm×250 mm，5 μm）制备型色谱柱； 341MC型旋光仪（Perkin-Elmer）；JASCO pu-2080高效液相仪（日本Jasco公司）；柱色谱硅胶（200～300目），薄层色谱硅胶GF（10～40 μm，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB）；ODS（50 μm，日本YMC公司）。

1.2 试药

救必应饮片由广州中医药大学提供，经沈阳药科大学潘英妮副教授鉴定为救必应 （Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮。石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇，均为分析纯（山东禹王实业有限公司化工分公司）；甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司）；乙腈（色谱纯，Sigma）；甲酸（色谱纯，沈阳试剂一厂）。

2 提取与分离

救必应乙酸乙酯提取物经硅胶吸附柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱。同时用制备薄层色谱、ODS柱色谱、重结晶及制备型高效液相色谱（HPLC）等方法进行分离纯化，得到化合物1（42.7 mg），2（2.8 mg），3（6.0 mg），4（15.2 mg），5（61.6 g），6（50.0 mg），7（7.0 g），8（7.0 mg）。并通过理化性质和波谱学特征确定其结构。化合物1～8的化学结构见图1。

3 结构鉴定

化合物1：白色针晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）给出3个芳香质子信号δ 7.41（2H，m，H-2，6），6.82（1H，d，J=8.0 Hz，H-5）和一个甲基信号δ 2.48（3H，s，8-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）给出了1个羰基碳信号δ 199.8（C=O），6个芳香碳信号δ 130.8（C-1），116.2（C-2），146.5（C-3），152.4（C-4），115.9（C-5），123.6（C-6），和1个甲基信号26.3（C-8）。将以上数据与文献[6]比较，鉴定化合物1为3, 4-二羟基苯乙酮（3, 4-dihydroxy-acetophenone）。

图1 化合物1～8的化学结构式

化合物2：无色油状物（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）给出了2个芳香质子信号δ 6.51（2H，s，H-2，6）和3个甲氧基信号δ 3.73（6H，s，3，5-OCH3），3.13（3H，s，7-OCH3），此外还有2个次甲级和1对亚甲基信号δ 3.99（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），3.48（1H，m，H-8），3.23（1H，dd，J=10.8，4.0 Hz，H-9a），3.09 （1H，dd，J=10.8，6.1 Hz，H-9b）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）共给出了12个碳信号δ 129.5（C-1），104.7（C-2，6），147.7（C-3，5），134.8（C-4），84.1（C-7），75.1（C-8），62.5（C-9），55.9（3，5-OCH3），56.3（7-OCH3）。与文献[7]对比分析，鉴定化合物2为thero-8S-7-methoxysyringylglycerol。

化合物3：白色无定形粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）中δ 7.34 （2H，s，H-2，6）为芳香质子信号，δ 5.14（1H，dd，J=5.0，4.0 Hz，H-2’），3.87 （1H，dd，J=11.6，4.0 Hz，H-3’a），3.75（1H，dd，J=11.6，5.0 Hz，H-3’b）为连氧氢信号，δ 3.91（6H，s，2 × OCH3）为2个甲氧基信号。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）给出碳信号δ 126.7（C-1），107.7（C-2，6），149.1（C-3，5），199.7（C-1’），75.5（C-2’），66.2（C-3’），56.9（2 × OCH3）。对比文献[8]，鉴定化合物3为2, 3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)-1-propanone。

化合物4：白色粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）中给出一组芳香质子信号：δ 7.05（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.96（1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6），6.78 （1H，d，J=8.2 Hz，H-5），组成ABX自旋耦合系统，提示结构中存在1,3, 4三取代苯环；3个不饱和双键信号：δ 7.57（1H，d，J=15.9 Hz，H-1’），6.28（1H，d，J=15.9 Hz，H-2’），5.71（1H，br.t，J=6.9 Hz，H-5’）；2个亚甲基信号：δ 4.61（2H，br.s，H-4’），4.45（1H，d，J=12.0 Hz，H-7’a），4.28（1H，d，J=12.0 Hz，H-7’b）；1个甲基信号：δ 1.76（3H，s，H-1’’）；以及一个糖端基质子信号：δ 4.32（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-H-1）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）谱中给出20个碳信号，其中一个酯羰基信号δ 168.9（C-3’）；10个不饱和碳信号δ 127.7（C-1），114.9（C-2），146.8（C-3），149.7（C-4），116.5（C-5），123.0（C-6），147.2（C-1’），115.2（C-2’），125.0（C-5’），135.9（C-6’）；一组葡萄糖碳信号δ 103.3（Glc-1），75.1（Glc-2），78.0 （Glc-3），71.7（Glc-4），78.1（Glc-5），62.8（Glc-6）；2个连氧亚甲基碳信号δ 66.1（C-4’），69.7（C-7’） 和1个甲基信号δ 14.2（C-1’’）。综合以上数据，查询文献[9]，鉴定化合物4为caffeic acid(1-hydroxyl-4-O-β-D-glucopyranosylprenyl)-ester。

化合物5：无色针晶（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，pyridine-d5）：δ 6.30（1H，d，J=7.6 Hz，Glc-H-1），5.59（1H，br.s，H-12），1.66（3H，s，29-CH3），1.42（3H，s，24-CH3），1.24（3H，s，26-CH3），1.08（3H，s，27-CH3），1.05（3H，s，25-CH3），1.09（3H，d，J=6.5 Hz，30-CH3）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）给出36个碳信号，其中30个为三萜母核碳信号δ 39.6（C-1），27.4（C-2），73.8（C-3），43.3（C-4），49.5（C-5），19.3（C-6），33.6（C-7），41.2（C-8），48.0（C-9），37.9（C-10），24.7（C-11），129.7（C-12），139.6（C-13），42.7（C-14），29.7（C-15），26.5（C-16），49.1（C-17），55.0（C-18），73.6（C-19），42.9（C-20），27.1（C-21），38.3（C-22），67.5（C-23），12.7（C-24），17.6（C-25），16.6（C-26），24.7（C-27），177.3 （C-28），27.2（C-29），16.3（C-30），剩余6个为葡萄糖信号δ 95.8（Glc-1），74.0 （Glc-2），78.6（Glc-3），71.1（Glc-4），78.3（Glc-5），62.4（Glc-6）。查阅文献[10]对比以上数据，鉴定化合物5为长梗冬青苷（pedunculoside）。

化合物6：白色无定形粉末（甲醇）。与化合物5相似，13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）同样给出36个碳信号，30个为三萜母核碳信号δ 39.2（C-1），28.8（C-2），80.6（C-3），43.5（C-4），56.8（C-5），19.6（C-6），34.2（C-7），40.9（C-8），48.2（C-9），37.4（C-10），24.6（C-11），128.6（C-12），139.6（C-13），42.5（C-14），29.6（C-15），26.4（C-16），49.0（C-17），54.8（C-18），73.0（C-19），42.4（C-20），27.0（C-21），38.0（C-22），23.9（C-23），64.9（C-24），16.5（C-25），17.6（C-26），24.9（C-27），177.3（C-28），27.4（C-29），17.0（C-30），及6个葡萄糖信号δ 96.2 （Glc-1），74.4（Glc-2），79.6（Glc-3），71.5（Glc-4），79.3（Glc-5），62.8（Glc-6）。综合比较可发现，化合物5和6为同分异构体，二者的区别仅仅在于23，24位羟基的位置，根据相关报道[108]：当24位为-OH时，对应的13C-NMR化学位移值分别为δ 23.5（C-23）/64.5（C-24）；当23位为-OH时，其对应的13C-NMR化学位移值分别为δ 67.9（C-23）/12.8（C-24）。因此将以上数据与文献[11]比较，鉴定化合物6为rotungenoside（ilexoside XXXV）。

化合物7：无色针晶（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，pyridine-d5） 给出一个不饱和双键氢信号δ 5.64（1H，br.s，H-12），和6个甲基信号δ1.71（3H，s，29-CH3），1.46（3H，s，24-CH3），1.15（3H，s，26-CH3），1.14（3H，d，J=6.7 Hz，30-CH3），1.08（3H，s，27-CH3），1.02（3H，s，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5） 给出30个碳信号，δ 39.2 （C-1），28.0 （C-2），73.9（C-3），43.2（C-4），49.0（C-5），19.1（C-6），33.6（C-7），40.7（C-8），48.1（C-9），37.5（C-10），24.4（C-11），128.4（C-12），140.3（C-13），42.4（C-14），29.6（C-15），26.7（C-16），48.6（C-17），54.9（C-18），73.0（C-19），42.7（C-20），27.3（C-21），38.8（C-22），68.4（C-23），13.4（C-24），17.6（C-25），17.1（C-26），25.0（C-27），181.0（C-28），27.4 （C-29），16.3（C-30）。对比NMR数据并查阅文献[12]发现该化合物为长梗冬青苷的苷元，因此鉴定化合物7为救必应酸（rotundic acid）。

化合物8：白色无定形粉末（甲醇）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）：δ 39.1 （C-1），28.8（C-2），80.6（C-3），43.6（C-4），56.8（C-5），19.6（C-6），34.3（C-7），40.8（C-8），48.2（C-9），37.5（C-10），24.6（C-11），128.3（C-12），140.4（C-13），42.5（C-14），29.7（C-15），26.8（C-16），48.7（C-17），55.0（C-18），73.1（C-19），42.8（C-20），27.3（C-21），38.9（C-22），24.0（C-23），65.0（C-24），16.4（C-25），17.5（C-26），25.0（C-27），181.0（C-28），27.5（C-29），17.2（C-30），以上数据与化合物7基本一致，同样是23，24位羟基的位置不同。查阅文献[13]比较后，鉴定化合物8为救必应酸的同分异构体rotungenic acid。