贝莱斯芽孢杆菌总RNA提取的Trizol改良法①

王 松 龚禹瑞 袁亚男 尚静静 张树竹 陈本佳 秦世雯

(云南大学农学院/云南省多年生稻工程技术研究中心 云南昆明650500)

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是芽孢杆菌属的一个新种，属于革兰氏阳性菌，存在于土壤、水体、动植物体内［1］。近年来，国内外研究人员相继分离到不同的B.velezensis菌株，发现其在促进植物生长、拮抗病原菌及食品发酵等方面发挥良好作用，且对环境友好、易于人工培养，在农业、食品、环保、工业和医药等领域具有重要的理论和应用研究价值［2-5］。获得高质量总RNA 是进行RT-PCR、qRT-PCR、cDNA 文库构建、Northern 杂交、转录组和翻译组测序等研究的基础［6-8］。因此，高效、简便的B.velezensis总RNA提取方法对该菌的深入研究和利用至关重要。

目前常见的细菌总RNA 提取方法有CTAB 法、强变性剂法、SDS-Phenol法及热硼酸法等［7，9］，这些方法各有优缺点，并根据菌体特性适用于不同细菌类型。有效的细胞裂解是提取高产量细菌总RNA 的关键步骤。目前细菌细胞壁破碎的方法有酶解法、玻璃珠法和超声波法［10-11］。相对于真核生物，细菌的RNA含量少，半衰期短，易降解；内外环境以及操作体系无处不在的RNA 酶（RNase）会导致细菌总RNA提取效果不理想［7］。此外，破碎的细胞内含物常与RNA 形成难溶的物质，导致RNA 难以分离。而国内关于高质量总RNA提取研究多集中于真核生物，尚缺乏高效、简便和经济的细菌高质量总RNA提取方法。

Trizol 法能够快速高效分离不同的生物来源样品的总RNA，所提取的总RNA 浓度和纯度高，不需要超速离心或多步酚—氯仿进行抽提［7］。然而，常规Trizol 法不能够有效裂解细菌细胞壁，且对RNase 的抑制效果并不理想，无法获得高质量的细菌总RNA［9］。因此，针对B.velezensis分泌蛋白量大且种类多、细胞壁厚等特点，本研究通过优化菌体培养条件、洗涤菌体次数、溶菌酶裂解细胞、液氮冷冻处理等方法，对传统Trizol法进行改良，获得了高质量的B.velezensis总RNA，为该菌的分子生物学研究提供了一种高效、简便和经济的总RNA提取技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

B.velezensis YQ1菌株由云南大学农学院植物病理研究室分离鉴定并于-80℃中保存。

1.1.2 主要试剂及仪器

Trizol 试剂（Invitrogen，美国），0.1% DEPC水，溶菌酶（200 mg/mL）（Solarbio，北京），D 2 000 DNA Marker（天根，北京），RibopureTMBacteria kit（Invitrogen，美国），台式高速冷冻离心机（Thermofisher，美国）等。

1.2 方法

1.2.1 常规Trizol法

（1）菌体培养及收集：将保存于-80℃的B.velezensis YQ1 菌株接种于LB 液体培养基中进行活化培养，30℃，180 r/min 振荡培养16 h。①固体培养条件菌体培养与收集：用接种环蘸取上述活化菌液在LB 固体培养基上划线，30℃恒温倒置培养24 h 后，取50 mg 菌体至1.5 mL 离心管中。②液体培养条件菌体培养与收集培养：将1 mL上述活化菌液加入200 mL LB 培养基中，30℃，180 r/min振荡培养，待OD600值达到1.0，8 000 g，4℃离心5 min，弃上清后取50 mg菌体至1.5 mL离心管中。

（2）总RNA 提取步骤：①往上述离心管加入0.75 mL Trizol 试剂，移液器吸打混匀菌体，以最大转速涡旋振荡3～5 min；②室温孵育5～10 min。加入0.2 mL 氯仿，上下颠倒混匀，室温孵育2～3 min；③4℃、12 000 g 离心10 min；④吸取上清，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，置于20℃中冰冻10 min；⑤4℃、12 000 g 离心10 min；弃上清，加1 mL 75%乙醇，温和振荡5～10 s；⑥4℃、7 500 g 离心5 min；⑦弃上清，超级工作台中晾置5～10 min 至乙醇完全挥发；⑧加入30～50 μL DEPC水溶解，获得的总RNA于-80℃冰箱保存。

1.2.2 Trizol改良法

（1）菌体培养条件优化：①固体培养条件下菌体培养时间优化：将活化菌液划线至LB固体培养基上，30℃倒置培养24、36和48 h，分别取50 mg菌体至1.5 mL离心管中。②液体培养条件下菌液OD600值优化：1 mL 活化的菌体加入200 mL LB 培养基中，30℃振荡培养至菌液OD600值为0.5、1.0、1.5 和2.0 时，8 000 g，4℃离心5 min，弃上清后取50 mg菌体至1.5 mL 离心管中。

（2）菌体DEPC 水处理：用25 mL 0.1%DEPC 水洗涤菌体，洗涤次数分别设置为1、2、3、4 次，充分混匀菌体后，4℃，8 000 g离心5 min，弃上清后取50 mg菌体至1.5 mL离心管中。

（3）溶菌酶处理：向最适DEPC 水处理后的菌体中加1 mL DEPC 水，混匀后分别加入20、30、40 μL 的溶菌酶，37℃静置30 min，4℃、10 000 g 离心1 min，收集菌体。

（4）液氮处理：将最适溶菌酶处理后的菌体置于1.5 mL离心管中，液氮冷冻2～3 min，未进行液氮处理的菌体设置为对照。加入Trizol 试剂前将上述离心管取出后置于冰上融化。

（5）总RNA 的提取：总RNA 提取步骤同上述常规Trizol法总RNA提取步骤。

1.2.3 改良Trizol法与试剂盒法的比较

RibopureTMBacteria Kit 试剂盒总RNA 提 取 方法如下：取1 mL 菌液（OD600为1.0），将250 μL 氧化锆珠滴入0.5 mL 的螺旋盖中；离心收集样品，加入350 μL RNAWTZ，涡旋振荡均匀，将RNAWTZ中的细胞转移到250 μL 的氧化锆珠，拧紧盖子，涡旋器中最大转速振荡10 min，充分溶解；4℃，14 000 g离心5 min；溶菌产物转移到新的1.5 mL 离心管，加入0.2 倍体积的氯仿，混匀，室温孵育10 min；4℃、14 000 g 离心5 min；水相转移到新的1.5 mL离心管，加0.5倍体积的无水乙醇，完全混合，将滤器放入2 mL 的收集管，将样品转移到滤器中；4℃、14 000 g 离心1 min；弃滤筒，滤器转入新的 滤 筒，加700 μL Wash Solution 1；4℃、14 000 g 离心1 min；丢弃滤筒，过滤器放入收集管，加500 μL Wash Solution 2/3；4℃、14 000 g离心1 min；弃滤筒，过滤器放入收集管，重复上述步骤一次；4℃、14 000 g 离心1 min，转移到2 mL的收集管；将预热至95℃的25～50 μL洗脱液加到滤池中心；4℃、14 000 g 离心1 min；重复上述两步一次，获得的总RNA于-80℃冰箱保存。

1.2.4 总RNA质量及完整性检测

（1）1%琼脂糖凝胶电泳检测：取总RNA 样品4～5 μL，于1%的琼脂糖凝胶电泳检测。200 V恒压，16 min。凝胶成像仪上观察条带，并记录结果。

（2）RNA 纯度和浓度检测：取2 μL 总RNA 样品，用超微量紫外分光光度计（Thermofisher，美国）分别检测A260/A280、A260/A230及浓度（ng/μL）。总RNA 的A260/A280值为2.0 且A260/A230值 为2.0～2.5时为高纯度总RNA。

（3）cDNA 的合成和扩增质量鉴定：利用RTPCR 法对Trizol 改良法提取的总RNA 进行反转录扩增质量鉴定，以常规法提取的总RNA作为对照。根据Takara AMV （V 3.0） Reverse Transcriptase（Takara，大连）的说明进行cDNA 第一链的合成和RT-PCR 扩增。RT-PCR 扩增片段为B.velezensis16S rRNA片段，所用引物为（F：5’-CTTCGGGTGTTACAAACTCTCG-3’；R：5’-TAAGCCAATCCCACAAATCTG-3’），利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 常规Trizol法提取

如图1 所示， 常规Trizol 法提取的B.velezensis总RNA 存在明显的降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表1），说明有杂质污染。推测培养基残留，B.velezensis培养过程中分泌物多，菌体细胞壁未完全破裂，造成常规Trizol 法无法提取到该菌完整的总RNA。

表1 常规Trizol法提取Bacillus velezensis总RNA的浓度和质量

2.2 Trizol改良法提取

2.2.1B.velezensis培养条件的优化

在进行菌体培养时，若B.velezensis生长对数期之前收集菌体，菌体量少；而进入对数生长期后，B.velezensis分泌大量的胞外酶（包括RNase），严重影响总RNA提取质量。为明确菌体培养环境及培养时间对B.velezensis总RNA 提取的影响，分别取LB 固体和液体培养基条件下不同培养时间的菌体进行总RNA提取。如图2和表2所示，在LB固体培养基条件下，24 h的总RNA浓度和纯度相对较高，说明在LB 固体培养基条件下，应尽量选取24 h（对数生长早期）的菌体进行总RNA 抽提。但24、36、48 h 总RNA 均有不同程度的降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表2），说明有蛋白、酚类、多糖等杂质污染。

表2 LB固体培养基条件下不同培养时间B.velezensis总RNA的浓度和质量

如图3 所示，在LB 液体培养基条件下当菌体OD600值为1.0 和1.5 时能够提取质量较高的总RNA，但存在降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表3），说明有蛋白、酚类、多糖等杂质污染；而OD600值为0.5 和2.0 时总RNA 严重降解。说明在LB 液体培养基条件下，菌体培养至OD600值为1.0～1.5 时是最佳的总RNA提取时间。

2.2.2 不同洗涤次数预处理对B.velezensis总RNA提取的影响

表3 LB液体培养基条件下不同B.velezensis菌体OD600值的总RNA浓度和质量

收集菌体时，残留的培养基和菌体分泌物等对总RNA提取存在严重影响，因此本研究采用DEPC水洗涤菌体的方法来减少杂质和RNase影响。为明确洗涤次数对减少杂质和菌体分泌物的效果，分别对LB 液体培养基条件下收集的菌体（OD600值为1.0）进行1、2、3、4次洗涤。如图4和表4所示，洗涤2 次的B.velezensis总RNA 质量较高，但均存在一定程度的降解。另外，DEPC 水洗涤处理后，总RNA浓度较低，不利于后续进行RNA纯化处理。

表4 DEPC水洗涤处理后B.velezensis 总RNA的浓度和质量

2.2.3 溶菌酶处理对B.velezensis总RNA提取的影响

为提高B.velezensis总RNA 提取量，需完全裂解菌体细胞壁，释放核酸。本研究将上述DEPC水洗涤2次后的菌体，分别用20 μL（20 mg）、30 μL（30 mg）、40 μL（40 mg）溶菌酶处理菌体。如图5和表5 所示，溶菌酶处理后，总RNA 浓度得到了明显提高，30 μL（30 mg）溶菌酶处理后提取的总RNA质量和浓度最高，但仍存在一定程度降解（表5）。说 明30 μL（30 mg） 溶 菌 酶 能 够 完 全 裂 解B.velezensis（OD600值为1.0）细胞壁，保证高浓度的总RNA提取量。

表5 溶菌酶处理后B.velezensis总RNA浓度和质量

2.2.4 液氮冷冻处理菌体对B.velezensis总RNA 提取的影响

通过DEPC 水洗涤和溶菌酶处理后，提取的总RNA仍存在降解情况，说明B.velezensis体内或提取过程中仍有RNAase 的影响。为抑制RNAase 活性，本研究对上述30 μL（30 mg）溶菌酶处理的菌体进行液氮冷冻。如图6 所示，提取菌体的总RNA可以清晰的看到23S、16S 和5S 条带。相较于未进行液氮处理的样品，液氮处理后提取的总RNA降解程度少，并且浓度和纯度高（表6），说明液氮处理能够有效降低B.velezensis内源性和提取过程中RNAase活性。

2.3 Trizol改良法和试剂盒法比较

表6 液氮冷冻处理提取B.velezensis总RNA的质量和浓度比较

由以上结果确定了B.velezensis总RNA Trizol改良法。为比较其与试剂盒法提取的总RNA效果，选取革兰氏阳性菌总RNA提取试剂盒RibopureTMBacteria Kit。如图7 所示，2 种方法均能获得完整和高纯度的总RNA，而Trizol法改良法提取的总RNA浓度更高，但相对于试剂盒法提取时间较长（表7）。另外，试剂盒法提取的单个样本总RNA价格比Trizol 改良法昂贵。因此Trizol 改良法适用于B.velezensis大批量样本的总RNA 提取，而试剂盒法适用于小批量样本的总RNA快速提取。

2.4 RT-PCR扩增检测

表7 Trizol改良法和试剂盒法提取的B.velezensis总RNA浓度和质量

以Trizol 常规法和改良法所提取的总RNA 为模板进行反转录合成cDNA 第一链。随后以其为模板，利用B.velezensis16S rRNA的荧光定量PCR引物进行PCR扩增。结果表明，Trizol常规法提取的总RNA 无法扩增出16S rRNA 片段，而Trizol 改良法提取的总RNA 能够扩增出明显的16S rRNA 片段，且片段大小与预期相符（163 bp），说明Trizol 改良法提取的总RNA能够满足RT-PCR要求。

3 讨论与结论

B.velezensis不仅具有富含肽聚糖的细胞壁，还具有强大的胞外酶分泌系统，同时易产生内源性RNase，这些特点加大了其总RNA提取难度［10-11］。贝莱斯芽孢杆菌在对数生长早期，细胞分裂旺盛，胞内活动主要以细胞分裂相关为主，细胞壁积累较少，分泌物较少，易于破碎细胞并获得高质量的总RNA。由于常规Trizol 法无法提取到B.velezensis完整的总RNA，因此，本研究比较了不同培养条件下，不同生长时期对B.velezensis总RNA提取的影响，结果表明，LB液体培养条件下的B.velezensis总RNA 提取质 量 较好，且OD600值 为1.0～1.5 是最佳提取时期。针对B.velezensis具有较强的胞外酶分泌系统特性，本研究通过DEPC水洗涤处理，在一定程度上减少了分泌物和残留培养基的影响，与枯草芽孢杆菌总RNA提取方法的研究结果相符［12］。本研究通过加入适量溶菌酶裂解菌体，提高了总RNA浓度，但该方法并不适用于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌［13-14］，推测溶菌酶对不同革兰氏阳性菌的裂解效率存在差异。另外，本研究通过对菌体液氮冷冻处理后发现，液氮能够抑制菌体破裂后的RNAase 活性，防止总RNA 在提取过程中的降解［10］。本研究还比较了Trizol 改良法与试剂盒提取B.velezensis总RNA 浓度效果，结果表明Trizol 改良法更加适合于大批量B.velezensis总RNA提取。

本研究提供了一种简便有效的B.velezensis总RNA 提取方法，为满足B.velezensis相关分子生物学研究提供了重要的技术支撑。