鸽圆环病毒Cap及Rep基因的克隆与进化分析

日孜瓦古·努尔东 米晓云 魏玉荣 吴建勇 苗书魁 马文戈 韩 涛 葛丽娟 魏 婕 黄 炯*

（1 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐830052）

（2 新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐830013）

鸽圆环病毒（Pigeon circovirus，PiCV，也被称为Columbid circovirus，CoCV）是圆环病毒科的一个成员，PiCV 可造成免疫抑制，继而增加其他疫病感染风险。PiCV 感染主要发生在青年赛鸽及肉鸽，12 月龄以下的青年鸽较易感，4 月龄以下的鸽最易感［1］。因此，PiCV 感染又叫“青年鸽病综合征”（Young pigeondisese syndrome，YPDS）。PiCV 呈球形，二十面体对称，无囊膜，直径为17 nm～22 nm，其基因组为单链环状DNA，大小为1. 7 kb～2. 3 kb，有两个主要的开放阅读框（ORFs）V1和C1及第三个较小的ORF C2组成。ORF V1 定位于有义链上，编码复制相关蛋白（Rep 蛋白）。ORF C1 位于反义链，编码衣壳蛋白（Cap 蛋白）［2］。PiCV 最早在1993 年由Woods 等在美国加利福尼亚发现，随后澳大利亚和许多欧洲国家也陆续报道发现PiCV［3-5］。余旭平等2007 年在中国浙江地区的病鸽体内首次检测到PiCV 的存在［6］。本病是近20 年来青年赛鸽中普遍存在的问题，但是目前还未见到新疆对于该病毒感染情况的报道。本研究中对采集于新疆和田某规模化种鸽场的200 份粪便和3 份鸽病料应用本实验室建立的PCR 方法进行PiCV 检测，对检测到的阳性样品进行测序确认；随机选择测序阳性样品进行Cap 及Rep 基因克隆、测序，应用DNAStar 软件比对分析显示所检测阳性样品病原来源一致，因此命名为PiCV-XJ2018；并应用MAGE5 将PiCV-XJ2018 与国内外30 余株PiCV 序列进行遗传进化分析，以探究PiCV-XJ2018 可能的来源，为PiCV诊断及防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1样品来源及采集

从新疆和田的某规模化种鸽场采集3～4 月龄病鸽的粪便及病料（病鸽心、肝、肺、肠及喉管）备用。

1.2试剂

TIANamp Virus DNA/RNA Kit 购 自TIANGEN 生物公司（中国北京）；Kodaq 2×PCR MasterMix with dye，2 000 bp DNA Marker，15 000+2 000 bp DNA Marker、pMD19-T 载体试剂盒、限制性内切酶购自TAKARA；Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System、Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System购自Promega；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购自北京全式金生物。

1.3引物

下载GenBank 中多个PiCV 基因组序列进行比对（GenBank 登录号：KX108805、KX431143、JF330089、KX108809、DQ090945），选择序列保守区域设计Pigeon CV-U/Pigeon CV-D为检测用引物，扩增长度为317 bp；Rep U/D为扩增Rep基因引物，扩增长度为992 bp；Cap U/D为扩增Cap基因引物，扩增长度为898 bp；3对引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.4样品检测

根据TIANamp Virus DNA/RNA Kit 说明书对200份粪便样品和3份病鸽肝脏组织样品提取DNA，使用Kodaq 2×PCR MasterMix with dye 试剂盒对模板DNA进行PiCV 的PCR 检测，PCR 扩增体系（总体积为25µL）：模板2µL，2×PCR MasterMix：12. 5µL，Pigeon CV-U/Pigeon CV-D 上下引物各0. 5µL，RNase Free dH2O：9. 5µL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。符合预期条带产物样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司（下文简称生工）测序。

1.5 Rep、Cap基因的PCR扩增

筛选上述样品中的测序阳性样品为模板扩增PiCV 的Rep、Cap 基因，PCR 扩增体系（总体积为50µL）：模板3µL，2×PCR MasterMix：25µL，上下引物：各1µL，RNase Free dH2O：20µL。PCR 扩增程序（1）Rep 基因：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存；（2）Cap 基因：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存；PCR 扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 Rep、Cap的基因克隆和测序

将PCR 产物目的片段经胶回收试剂盒纯化后与pMD19-T 载体连接，转化至Trans1-T1 感受态细胞，筛选、鉴定阳性克隆送生工测序。

1.7序列比较分析

测序序列经NCBI 中BLASTn 比对分析，再用Lasergenev7. 1 DNAStar 软件进行序列整理和校对、拼接，将拼接后的核苷酸序列分别与GenBank中国内外鸽圆环病毒序列进行同源性比较，利用MEGA5.0 软件绘制系统进化树。

2 结果

2.1病料筛选结果

将PiCV 检测引物扩增的PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示200 份粪便样品和3份病鸽肝脏组织样品的PCR 产物中部分样品可见约317 bp 的特异性片段，与预期大小相符（部分PCR 扩增结果如图1）。任选6 份阳性PCR 产物送生工测序后，经BLASTn比对，证实为PiCV阳性。

图1 部分样品PCR鉴定

2.2 Rep、Cap基因扩增结果

从测序的6 份阳性样品中随机抽取1 份样品作为模板DNA，进行PiCV 的Rep、Cap基因PCR 扩增，电泳结果显示Rep、Cap 基因扩增可见约992 bp、898 bp的特异性片段，与预期大小相符（图2）。将扩增产物进行回收、构建重组质粒后酶切鉴定（图3、4）并测序。测序后的基因序列经BLASTn比对，确认是PiCV的Rep、Cap基因序列。

图2 Rep、Cap基因扩增结果

图3 Rep重组质粒鉴定

图4 Cap重组质粒鉴定

2.3 Rep、Cap基因的同源性分析

用DNAStar 软件中的MegAlign 对自测的Rep、Cap 基因分别与GenBank 中国内外PiCV 毒株相应的Rep 及Cap 基因序列进行比对。结果显示自测PiCV-XJ2018 株Rep 基因与GF71/Guangdong/2014（KX108799）的同源性最高，其核苷酸同源性为97. 17%，氨基酸同源性为99. 05%；30 株Rep 基因核苷酸同源性在91. 9%～97. 2%之间；PiCV-XJ2018 株Cap基因与GF82/Guangdong/2014（KX108805）的同源性最高，其核苷酸同源性为94. 98%，氨基酸同源性为97. 79%；34 株Cap 基因核苷酸同源性在76. 3%～95.0%之间。

2.4 Rep、Cap基因进化树分析

用MEGA5.0软件分别对30株Rep基因（如图5）、34 株Cap 基因构建进化树（如图6）。Rep 基因进化树结果显示，PiCV-XJ2018株与国内2014年广东及上海地区的毒株处于一个大分支，说明它们亲缘关系较近。Cap 基因进化树结果显示，所分析34 株毒株的Cap基因明显分为5大组，PiCV-XJ2018株与大部分国内毒株处于基因B组，表明这些毒株亲缘关系较近。

图5 PiCV毒株Rep基因的系统进化树

图6 PiCV毒株Cap基因的系统进化树

3 讨论

PiCV 感染主要发生在青年赛鸽及肉鸽，12 月龄以下的青年鸽较易感，4 月龄以下的鸽最易感［1］。PiCV 不仅可通过环境如粪便、污染病毒的饲料及饮水等方式水平传播，还具有经卵垂直传播的风险［7,8］。2017年，台湾学者对淘汰赛鸽中164羽死亡鸽子进行PiCV 检测，有96. 95%（159/164）呈PiCV 阳性［9］。同年，有学者对收集于安徽、广东、上海及江苏的78 份鸽粪便、162份咽拭子及4份饮水样品进行了PiCV 检测，其中57.69%的粪便、1.23%咽拭子及25.00%饮水中检测到PiCV［10］。鸽圆环病是一种免疫抑制性疾病，易使病鸽继发感染其他疾病继而致死，影响种鸽及赛鸽等生产性能及使用价值，危害鸽养殖业的发展，损害养殖户经济利益。新疆是否存在PiCV 及其感染情况如何，尚未发现相关文献报道。

本研究中参考GenBank 中序列，设计了检测引物，对采集的200 份粪样及3 份病鸽肝脏组织样品进行检测，结果显示有93 份粪便样品和3 份病鸽肝脏组织样品为阳性样本，即阳性率47.29%。PCR 扩增阳性样品随机送样6 份测序，经NCBI 数据库比对测序的317 bp均为PiCV核酸片段。PiCV的Cap蛋白是病毒主要抗原蛋白，该蛋白与Rep 蛋白相比变异性相对较高，通常被用于遗传进化分析［11］。Cap蛋白还与病毒免疫原性及致病性相关，被用于建立诊断或检测方法［12、13］。本研究所测毒株PiCV-XJ2018 与国内外33 株PiCV 的Cap 基因遗传进化分析可见，这34 株病毒被分为五大组（Group A-E），与前期研究报道结果一致［4］。PiCV-XJ2018 与2014 年广东毒株及上海毒株处于同一分支，属于基因B 组。PiCV-XJ2018 Cap 基因核苷酸与其他33 株同源性在76. 3%～95. 0%，与GF82/Guangdong/2014（KX108805）的同源性最高，达94. 98%，氨基酸同源性为97. 79%。PiCV-XJ2018 与国内外29 株PiCV 的Rep 基因遗传进化分析可见，Rep 基因分为7 个大分支，其中PiCVXJ2018 仍与2014 年广东毒株及上海毒株处于同一分支，与GF71/Guangdong/2014（KX108799）的同源性最高，其核苷酸同源性为97. 17%，氨基酸同源性为99. 05%；30 株Rep 基因核苷酸同源性在91. 9%～97. 2%之间。综合Rep 和Cap 基因的遗传进化分析可见，PiCV-XJ2018 与2014 年广东毒株高度同源，亲缘关系最近。

此次在新疆鸽群中检测到种鸽感染PiCV，猜测可能与种鸽引种关系密切。此结果急需引起兽医工作者及养殖户的关注，需及时进行PiCV 感染现状监测排查，对检出阳性的种鸽场应进行隔离净化。种鸽引种、育种及赛鸽放飞等环节避免PiCV 扩散。同时我们应加强有关快速诊断及防控产品研究［13］。

综上，本文对新疆地区PiCV 进行调查，结果显示被调查种鸽群存在一定比例PiCV 感染（阳性率47.29%），遗传进化分析表明新疆该鸽厂发病毒株可能来源于广东地区。