花花柴抗逆相关转录因子WRKY的鉴定及分析

余从巧 邓 芳 赵红山 徐靖辰 王彦芹，2*

（1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300）

（2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔843300）

自然条件下，极端温度［1］、水胁迫［2］、盐胁迫［3，4］、病原物［5］、氧化胁迫等因素都可能严重影响植物的生长发育［6］。为降低由此带来的恶劣影响，生物体通过自身的调节作用来抵御逆境胁迫［7］，其中WRKY家族起重要作用［8］。WRKYs是植物转录因子中较大的一类，其启动子靶点(W-box)具有(T)(T)TGAC(C/T)序列，它是由大约60 个保守残基组成的DNA 结合区域，该区域包含高度保守的WRKYGQK七肽［9］，因此而得名。

自Ishiguro 等从甘薯中克隆第一个WRKY 基因SPF1 以来［10］，研究人员已从玉米、水稻、拟南芥、可可、烟草、棉花等多种植物的根、叶片、花序、种子、微观组织中克隆了超过500 个WRKY 基因的ESTs 序列。大量研究表明，WRKY 基因在抗旱、耐热、抗盐碱、抗病虫害方面均有显著的作用。例如：水稻中OsWRKY11 的过表达，可以使其抗旱性增强［11］；拟南芥AtWRKY39 的过表达，可以使植株耐热性提高［12］；棉花的GhWRKY17 过表达，使其具有耐盐碱的能力［13］；烟草中的NtWRKY3 和NtWRKY6 的基因沉默表达，可以使烟草抗烟草天蛾［14］。

自1994 年，WRKY 基因被争相研究，水稻［15，16］、拟南芥［17］中对于WRKY 基因的描述与研究都相对详尽，但其在花花柴中研究较少。花花柴（Kareliniacaspica）属于菊科，花花柴属，主要分布于内蒙古西部、宁夏、甘肃中部及新疆地区，生于戈壁滩、沙丘、草甸盐碱地或苇地水田旁。作为塔克拉玛干沙漠与绿洲的过渡植物，花花柴在防风固沙方面有显著的作用［18］，对沙漠植物花花柴抗逆性的研究，将有利于抗逆性植物及其基因资源的发掘和利用。本文以花花柴为研究对象，从本课题组已完成的常温-高温转录组测序结果中筛选出差异表达的WRKY 基因（差异表达倍数在两倍以上），从中挑选出两个表达趋势相反的基因进行表达模式分析，并将筛选出的15 个WRKY 基因与水稻、拟南芥中的WRKY 基因建立系统发育树进行分析，利用转录组测序结果对花花柴中WRKY基因的结构域进行功能预测。

1 实验用品与方法

1.1 实验用品

1.1.1 实验材料与试剂

花花柴植株样品来源于塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室恒温培养室，处理环境为塔里木大学逸夫实验楼气候培养箱。按0、2、4、8、12（h）时间梯度摘取叶片，用液氮速冻，置于-80℃保存备用。

利用TransGen Biotech 的试剂盒TransZolPlant、TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2*EasyTaq PCR SuperMix、液氮、TAE缓冲液、DEPC。

1.1.2 实验仪器与工具

电子天平、PCR 仪（eppendorf 型号）、低温高速离心机（eppendorf 5415R）、核酸微量分析仪（Thermo NanoDrop One）、电泳仪（BIO-RAD 型号）、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、研钵。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

对前期本课题组已完成的花花柴常温-高温转录组测序数据分析，筛选出15 个差异表达的WRKY基因，利用ggplot2 对其做热图分析。利用NCBI 中的ORF Finder 查找出WRKY 基因的开放阅读框，利用MEME 在线软件对其氨基酸序列进行保守结构域分析；再利用MEGA6 和Clastx 将这15 个WRKY 基因与水稻、拟南芥中的WRKY 基因进行系统发育树的构建，最后用PLACE 软件对基因序列顺式元件进行功能预测。

1. 2. 2 高温胁迫下花花柴WRKY 基因的表达模式分析

选择有8-10 个叶片的室内培养的花花柴植株，在恒温气候箱中45℃高温处理，将摘取的幼嫩叶片利用试剂盒TransZolPlant 提取总RNA，再用TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix for PCR 的试剂盒反转录为cDNA。按时间梯度五个一组进行表达模式分析。以cDNA 为模板，在PCR 管中加入Primer-R 0.4µL、Primer-F 0.4µL、模板1µL、2*EasyTaq PCR SuperMix 10µL，用ddH2O 补充至20 µl。用18S 与目标基因进行对照实验，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析。

2 结果与分析

2.1 花花柴WRKY基因家族的转录组学分析与筛选

以高温（45℃）这一逆境条件处理花花柴2 h，对WRKY基因家族进行转录组学分析，其中绿色代表基因下调表达，而红色代表基因上调表达。所研究的15 个基因中上调表达的占8 个，下调表达的占7 个（ 如 图 1）。 其 中 CL1655. Contig1_All、Unigene16322_All、Unigene8397_All、Unigene20809_All、CL5354. Contig2_All、CL4493. Contig1_All、CL4493.Contig2_All、Unigene31044_All 在高温处理下上调表达，其中Unigene31044_All 基因上调表达的倍数最多，达3 109. 3 倍。 而Unigene19088_All、Unigene13217_All、 CL3390. Contig4_All、 Unigene24032_All、Unigene12940_All、Unigene10861_All、CL4998.Contig1_All在高温环境下下调表达。

2.2 花花柴WRKY基因的保守序列分析

通过MEME 软件比对分析（如图2），发现15 个WRKY 蛋白均含有WRKY 家族绝对保守的氨基酸残基WRKYGQK，有时也可采用WRKYGKK 的形式［9］，该结构是WRKY 结构域中的核心序列。 除WRKYGQK（WRKYGKK）序列具有高保守性，在第5位的D（天冬氨酸Asp）、第24 位的R（精氨酸Arg）、第26 位的Y（酪氨酸Tyr）、第29 位的C（半胱氨酸）同样具有高保守性。

图1 花花柴WRKY基因的转录组学分析热图

图2 花花柴WRKY家族保守结构域序列比对

2. 3 花花柴及几种模式植物WRKY 基因的系统发育分析

通过联合建树，将WRKY 基因家族分为7 个亚族，分别表示为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（如图3）。花花 柴Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655.Contig1_All 这3 个WRKY 基 因 在Ⅲ族；Unigene12940_All、CL4998. Contig1_All2 个WRKY 基 因在Ⅳ族；Unigene31044_All、CL5354. Contig2_All2 个WRKY 基 因 在Ⅴ族；CL3390. Contig4_All、CL4493.Contig1_All、CL4493. Contig2_All、Unigene19088_All4个WRKY 在Ⅵ族 中；Unigene20809_All、Unigene10861_All、Unigene24032_All、Unigene13217_All4个WRKY基因在Ⅶ族。

图3 花花柴与拟南芥、水稻WRKY基因系统发育树

2.4 花花柴WRKY转录因子的功能预测

在PLACE 软件上对顺式元件进行功能预测，从表1 中可以发现筛选出的15 个基因中有共同的、与生态逆境有关的顺式作用元件：ABR1 结合元件、CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、CuRE 核心序列、Nt-BBF1、KST1、MYB1AT、W 盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 识别位点、P 盒、LTRE 核心序列、HSE，在不同基因中顺式作用元件的数量存在着一定的差距。如与高温有关的HSE 热激元件，仅在CL4998. Contig1_All 中存在。但大部分基因中含有与HSEs 共同促进热激启动子活性的CCAAT 盒。与低温相关的有：LTRE-1、MYC识别位点、LTRE-1 核心序列，MYC识别位点在各个WRKY 基因中数量都较多。与干旱这一非生物胁迫有5个顺式作用元件都与其相关，分别是：ABRE 类、KST1、ACGT 盒、MYB 识别位点、MYC识别位点。与抗病相关的元件W 盒也存在于各基因中，只是数量存在差异。

2.5 利用表达模式分析功能预测的准确性

从15个差异表达的WRKY基因中筛选两个表达趋势相反的基因：CL4493. Contig1_All、CL4998. Contig1_All 进行表达模式分析。由图4 可以看出基因CL4493.Contig1_All 在未处理时有较少量的表达，高温处理2 h 后表达量降低，在处理4 h 后表达量明显升高，在处理8 h 后表达量较4 h 低，但较未处理时

高，在处理12 h 后表达量在整个处理时间中最高。基因CL4998. Contig1_All 在处理4 h 前表达量均较低，在处理4 h 后表达量增加，但是在8 h 后表达量降低，在处理12 h 后表达量增加在整个处理过程中达到最高。

表1 花花柴WRKY基因顺式作用元件功能预测

图4 CL4998.Contig1_All、CL4493.Contig1_All的表达模式分析

3 讨论

近年来，在水稻［11］、拟南芥［12］、大豆［19］、烟草［14］、棉花［13］等植物中对于WRKY 基因的研究尤为火热，阐述了WRKY 基因在非生物胁迫下至关重要的作用［20］，但是查阅大量文献数据发现鲜少有关于花花柴这一荒漠植物该基因的研究。

本文主要是对基因进行筛选分析，着重研究花花柴WRKY转录因子在高温胁迫下差异表达的15个基因。这个数据相对于水稻中的84个WRKY转录因子，拟南芥中的72 个WRKY 基因较少，但较烟草的11 个WRKY 基因多，因此分析花花柴WRKY 数量较少可能是物种间差异及生长环境不同带来的影响。通过热图分析，初步推断高温对基因的影响，在这15个基因中有8 个基因上调表达，7 个下调表达。我们将这15 个蛋白的氨基酸序列进行比对分析，发现均含有WRKY 蛋白的保守结构域WRKYGQK（WRKYGKK），两者最大的不同在于第6 位上的谷氨酰胺（Q）和赖氨酸（K）的不同，其中有14 个氨基酸是WRKYGQK，仅有Unigene20809_All 这个氨基酸为WRKYGKK。

通过对系统发育树同亚族其他基因的功能分析，推测花花柴WRKY 基因可能存在的作用。在Ⅲ中与3 个花花柴WRKY 同源性较高的ATWRKY70 具有抵御干旱胁迫［21］、抗病［22］的功能，因此推测Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655. Contig1_All同样具有抵御干旱胁迫、抗病的功能。在Ⅳ中与Unigene12940_All 同源性较高的ATWRKY39 具有抵御氧化胁迫［23］、应对高温胁迫［24］的功能，因此推测Unigene12940_All 在氧化胁迫、高温胁迫响应中有重要意义；与CL4998. Contig1_All 同源性较高的是ATWRKY7，该基因具有抗病［25］的功能，因此我们推测CL4998. Contig1_All 可能具有抗病的功能。在Ⅴ中与Unigene31044_All 同源性较高的ATWRKY61、与CL5354.Contig2_All 同源性较高的OsWRKY4 都具有抗病［26、27］功能，因此推测Unigene31044_All、CL5354.Contig2_All 在抗病方面有重要意义。在Ⅵ中与CL3390. Contig4_All 同源性较高的ATERKY34 具有应对低温胁迫［28］、影响雄性配对发生［29］的作用，因此推测CL5354.Contig2_All 在应对低温胁迫、影响雄性配对发生起重要作用；与CL4493. Contig1_All、CL4493. Contig2_All 同 源 性 较 高 的ATWRKY26 具 有抗高温［24］、干旱、NaCl［34］胁迫的功能，可推测这两个基因同样具有以上功能；与Unigene19088_All同源性较高的ATWRKY33 具有抵御干旱、抗NaCl 胁迫［31］、抗 高 温［32］及 抗 病［33］的 功 能，由 此 推 测Unigene19088_All 同样具有以上功能。Ⅶ族中与Unigene20809_All 同源性较高的ATWRKY51、与Unigene10861_All 和Unigene24032_All 同源性较高的ATWRKY57、与Unigene13217_All 同源性较高的ATWRKY71都具有抗病［34，35］的作用，因此推测该亚族的4个花花柴WRKY基因具有抗病的作用。

通过预测顺式作用元件功能发现，一个作用元件都不只存在于一个基因上，每一个顺式作用元件也不只具有一个功能。ID 为Unigene10861_All 的基因中就含有CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、KST1、W盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 识别位点、HSE 等多个顺式作用元件；ABRE 类也同时具有耐旱、缺氧、氧化胁迫等多个功能。每个顺式作用元件的作用位点都有差别，它们利用各自耐旱、耐高低温、抗病、耐盐、抗氧化等相关功能，相互协调，共同作用，使同一植株中同一基因家族的不同基因表现出其差异性，发挥不同功能。针对外界不同程度的非生物胁迫调节自身的表达量，以此来适应外界的变化，以维持植物正常的生长发育。

研究表明盐胁迫［3］、激素、干旱［2］、病虫害［5］、极端温度［1］等非生物胁迫对WRKY 基因的表达量有一定的影响。AtWRKY25 和AtWRKY26 在未处理时均不表达，但在高温处理后表达量明显增加［36］。而通过对筛选出来的2个基因进行表达模式分析，发现在对植株进行高温处理时，两个基因存在相同的变化趋势，即在处理前表达较弱，而在处理4 h 后基因的表达量均存在先增加后减少再增加的过程。该变化趋势与前期测定花花柴对高温胁迫响应的生理变化趋势一致，表现出胁迫-应激-适应的波浪式变化过程［37］。以上分析均说明高温对WRKY 基因的表达量有明显影响。

本研究为荒漠植物及其基因资源的发掘利用提供一定的参考价值，但仅对基因前期工作进行探究，并未对基因的功能及调控系统进行具体的研究，因此还需要后续更深入的功能分析。