新疆阿克苏地区部分猪场伪狂犬病病毒gE蛋白抗体ELISA检测与分析

高佳敏 潘姣姣 魏鑫豪 桂成坤 孙世浩 张秋林 热衣汗·玉素甫 李莲瑞 石长青

（塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔843300）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一种在家畜之间流行的高度传染性疫病，猪为该病的主要传染源和宿主［1］。母猪以繁殖障碍为主要症状，如妊娠母猪流产、死胎等情况；仔猪则以发热、腹泻、呼吸困难、神经症状如共济失调、肌肉震颤等为临诊特征［2］；患病公猪会出现睾丸肿胀、萎缩等症状，严重时会造成公猪不育，影响繁殖数量，为生猪养殖业带来巨大的经济损失［3］。

阿克苏地区位于新疆维吾尔自治区中部，塔里木盆地北部，天山山脉中段南麓。生猪养殖业是阿克苏地区畜牧业经济发展的优势产业之一，是阿克苏地区畜牧业发展的一个重要方向［4］。本次血清学调查主要在2019 年1 月-11 月期间，采用间接酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）的测定方法，检测新疆阿克苏地区6 个生猪标准化规模养殖场共计644 份血样的PRV-gE 蛋白抗体情况，以期了解阿克苏地区部分猪场伪狂犬病毒野毒的感染情况。

1 材料

1.1样品来源

2019 年1 月-11 月期间，采集自新疆阿克苏地区6 个规模化猪场644 份全血，将6 个生猪养殖场进行编号A-F。采集全血样品为不同年龄阶段的猪群，分别为经产母猪、种公猪、后备母猪、保育猪、仔猪。所采集血样的6 个猪场均按照免疫程序免疫过gE 基因缺失疫苗，且未免疫过gE基因未缺失疫苗。

1.2试验仪器和材料

猪伪狂犬病病毒gE（PRV gE）抗体ELISA 检测试剂盒（北京金诺百泰生物技术有限公司）、自动酶标仪（美国BIO-RAD+iMarK）、采血器、离心机、微量移液器（Eppendorf）、计时器、震荡仪、量筒、烧杯、锥形瓶等。

2 方法

2.1样品采集

使用采血器无菌采集猪的前腔静脉血3-5 mL/头，待血清析出后，将血样放置带有冰袋的泡沫箱内带回实验室。将血样放入离心机3 000 rpm/min 离心5 min，吸取上部淡黄色、透明清亮液体至无菌离心管，编号后立即检测。

2.2 检测方法

按照PRV-gE 抗体ELISA 检测试剂盒说明书对离心好的新鲜血清进行PRV-gE蛋白抗体水平检测。

首先，将1:1稀释样品、阴性对照血清（NC）、阳性对照血清（PC）加入抗原包被板相应孔中室温（25±3 ℃）孵育1 h。然后，弃去孔中液体并进行洗涤；每孔加入100µl抗PRV gE HRP 标记抗体，室温孵育20 min；孵育结束后弃去孔中的液体，再次进行洗涤。洗涤完成后向每孔加入100 µl 的TMB 底物液，在室温条件下孵育15 min。再向每孔加入50 µl 的终止液，以终止酶促反应；最后，使用自动酶标仪在450 nm波长条件下测量吸光度值。

2.3 结果判定

（1）试验成立条件：判定本试验是否成立，需要满足以下条件：①阴性对照的OD450nm平均值＞0.7；②阳性对照S/N 值＜0.3；③如果检测结果不在界定范围则需要重新进行检测。（本实验检测结果中有两份样品检测结果为可疑样品，重复检测后判定为阴性）

（2）NC OD值计算方法：NC OD值=（NC1+NC2）/2。

（3）样品S/N值计算方法：S/N=样品OD值/NC OD值。

3 结果

3.1不同规模化猪场PRV-gE 感染率分析

对阿克苏地区不同规模猪场PRV-gE 感染情况进行统计分析，结果详见表1。

表1 阿克苏地区规模化猪场伪狂犬病毒gE抗体检测结果

由表1 可知：被检猪血清644 份，gE 蛋白抗体阳性13 份，阳性率为2. 02%。生猪养殖场A-F 中，B、D、E 共3 个场（养殖场）检测出gE 抗体阳性血清，阳性率分别为4.26%、4.25%、6.38%。6个猪场的平均抗体阳性率为2. 48%。结果显示，新疆阿克苏地区部分猪场的PRV-gE蛋白抗体阳性率偏低，但PRV在阿克苏地区仍存在。

3.2 不同年龄猪群PRV-gE 抗体阳性率分析

对阿克苏地区部分规模化猪场不同年龄阶段猪群进行PRV-gE感染情况进行分析，结果详见表2。

表2 阿克苏地区规模化猪场不同年龄阶段猪伪狂犬病毒gE抗体检测结果

由表2 可以看出：后备母猪、经产母猪、保育猪、种公猪、仔猪的PRV gE 抗体阳性率分别为1. 36%、2.61%、1.82%、1.52%、2.78%。结果显示：所检测猪群中，PRV gE 抗体阳性率最低的是后备母猪，最高的是仔猪。

4 讨论

经调查，本试验的6个规模化猪场采用的伪狂犬疫苗均为PRV-gE 基因的缺失疫苗。PRV 病毒属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、ɑ-疱疹病毒亚科（Alpha herpesviridae），具有典型的疱疹病毒特征，PRV 的gE、TK、gG、gI 等毒力基因是其复制的非必须基因［5］；其中gE 蛋白具有最典型的膜蛋白特征，对PRV 侵袭神经、体内毒力表达和沿着神经传递都起着十分重要的作用［6］。几乎所有的PRV 野毒株都可以表达gE糖蛋白，且gE缺失毒株与野生毒株相比，毒力大大降低，因此gE 基因在PRV 的野毒株鉴别诊断中具有重要意义［7］。本试验采用猪伪狂犬病毒的gE 蛋白作为包被抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒，对新疆阿克苏地区6 个生猪标准化规模养殖场共计644 份血样的gE蛋白抗体情况进行了检测与分析。

4. 1 阿克苏地区不同规模化猪场PRV-gE 蛋白抗体水平

检测结果表明：644份血清中，检测出PRV-gE抗体阳性血清13 份，阳性率为2. 02%，低于2018 年魏其［8］报道的北疆地区PRV-gE 蛋白抗体阳性率45. 14%，低于2018 年马博［9］报道的新疆巴州地区PRV-gE抗体阳性率9.48%，低于2013年宋刚华［10］报道的新疆库车县PRV-gE 抗体阳性率13. 70%，也低于2015 年高亮［11］报道的伊宁市gE 抗体阳性率19.31%。说明阿克苏地区生猪养殖场的伪狂犬病免疫保护工作做得比较好。6个规模化猪场中有3个养殖场检测出有gE 阳性抗体，平均gE 抗体阳性率为2.48%；不同猪场的感染率不同，说明各个猪场对猪伪狂犬病的防控程度不一，这可能与各猪场的地理位置、养殖密度、饲养管理水平和疫苗程序等多方面因素相关。

4. 2 阿克苏地区规模化猪场不同类别猪群PRV-gE蛋白抗体水平

不同年龄阶段的猪群猪伪狂犬病野毒感染情况存在差异，但差异情况并不明显。调查结果表明：经产母猪和仔猪阳性率较高，分别为2.61%和2.78%；后备母猪和保育猪的阳性率稍低，分别为1. 36%和1.82%；种公猪的阳性率最低为1.52%；与2018 年马博［9］报道的新疆巴州地区的结果相一致，与2017 年苏玉贤［12］报道的河南地区平顶山市的结果也相一致。其中，经产母猪阳性率较高说明经产母猪经过多次免疫，抗体效价较高；但也极有可能是经产母猪带毒普遍，只表现阴性感染，带毒而不发病。若是阴性感染就需要加强经产母猪的猪伪狂犬病抗原水平检测［13］。而仔猪阳性率较高可能是由染病母体传染给胎儿，伪狂犬病病毒可通过胎盘垂直传给胎儿，且被感染种猪和所生仔猪可长期带毒。

通过试验可以发现，阿克苏地区预防PR 的免疫效果较好，但部分猪场仍有感染的情况，因而还需加强猪场饲养管理和疾病预防工作。