福州2009—2014年甲型H1N1流感病毒株HA基因进化分析

陈智伟　姚栩　谢乃鸿

【摘要】 目的：分析福州地区2009-2014年甲型H1N1流感病毒株的HA基因序列和遗传特征。方法：采集流感样病例的咽拭子标本，用MDCK细胞培养法和Real-time RT-PCR法对6株分别来自2009-2014年的病毒株进行病毒分离、鉴定，HA基因片段通过RT-PCR法进行扩增后克隆到pMD18-T载体上，并测定6株病毒株的HA基因序列。通过生物软件BioEdit对该分离株和GenBank中相关毒株的序列进行基因进化树分析。结果：6株分离株的HA基因推导氨基酸序列与参考株A/California/04/2009相比，2009-2014年HA1区氨基酸发生了突变，主要是位于136、145、188、189、192和193位点。结论：近几年，福州地区H1N1流感的HA基因序列与世界流行的病毒参考株具有高度同源性，并多处氨基酸发生替换而产生抗原性漂移。

【关键词】 甲型流感病毒； 血凝素； 序列分析； 进化树

【Abstract】 Objective：To investigate HA genetic characteristic of influenza type A H1N1 virus in Fuzhou from 2009 to 2014.Method：Acquisition of influenza like cases of throat swab specimens by MDCK cell culture method and Real-time RT-PCR method in 6 strains from 2009 to 2014 were isolated and identified. The HA gene fragment was amplified and cloned into pMD18-T vector by RT-PCR method， and determination of HA gene sequences of 6 virus strains.The phylogenetic tree of the isolates and GenBank was analyzed by BioEdit.Result：The deduced amino acid sequence of HA gene of 6 strains compared to reference virus A/California/04/2009， HA protein of the isolate viruses from 2009 to 2014 had amino acid mutation in sites of 136，145，188，192 and 193.Conclusion：In recent years，the HA gene sequence of H1N1 influenza in Fuzhou region is highly homologous to the worlds most popular virus reference strains，and many amino acids are replaced to produce antigenic drift.

【Key words】 Influenza H1N1 virus； HA gene； Sequence analysis； Phylogenetic tree

First-authors address：Fuzhou Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.07.002

2009年第一例甲型H1N1流感病毒在墨西哥被檢测出后在该地区流行，并在全世界各个国家和地区大流行。经过世界卫生组织（WHO）鉴定此型流感为“人感染猪流感”，后将其更名为“甲型H1N1流感”。2009年6月11日，界卫生组织将甲型H1N1流感流行级别提升至6级。猪流感病毒属正黏病毒科，A型流感病毒的负链RNA病毒，是引起猪呼吸道疾病的重要病原体[1]。此次流行主要是因为猪的呼吸道上皮细胞同时感染禽流感病毒受体和人流感病毒受体，从而在猪上皮细胞内进行基因重排（抗原转变，antigen shift），最近发现的H1N1流感病毒重组由于基因同源重组[2]。血凝素抗原（HA）蛋白是介导病毒和细胞表面结合的主要蛋白，也是流感的重要保护性抗原[3]。流感病毒感染同一细胞时常发生基因重排，从而产生新的病毒株。其中HA是流感病毒病毒的主要抗原，是由三个血凝素蛋白聚合在一起形成三聚体结构，头部由HA1亚单位形成，是流感病毒与细胞受体结合的关键蛋白，该蛋白和机体免疫相关，此外HA1蛋白是流感发生抗原性漂移的分子基础，此次新型甲型H1N1流感病毒大流行，主要也是因为H1N1流感病毒的基因重排和HA1蛋白的抗原性漂移[4]。为进一步了解福州市新型甲型流感H1N1病毒的流行和基因特性，本研究选择6株病毒株，分别来至福州地区2009-2014年的病毒株，进行HA基因组序列测定，对其HA基因的特征和进化特点进行分析，为进一步开展福州地区流感防治工作以及为流感病毒分子生物学研究提供科学依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取6株分别来自2009年

1月-2014年1月新型甲型流感病毒株，来源于福州市疾病预防控制中心的H1N1流感病毒株并保存-80 ℃。

1.2 主要试剂和细胞 狗肾传代细胞（MDCK）由福建省疾病预防控制中心提供，流感病毒的标准抗原和标准抗血清由国家流感中心提供。RNA提取试剂盒购于TAKARA，RT-PCR试剂盒采用TAKARA公司（OneStep RT-PCR Kit），扩增引物采用世界卫生组织官方网站提供的HA基因扩增引物，扩增产物用于测序。

1.3 引物设计与合成 核酸扩增及序列测定引物参照WHO提供的HA基因组测序引物[5]。

1.3.1 核酸提取与cDNA的制备 病毒核酸提取在生物二级实验室进行，采用TAKARA公司的一步法试剂盒。

1.3.2 HA基因扩增与分析 用于琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增产物进行分子量大小分析，并对PCR产物纯化回收后进行测序分析。

2 结果

2.1 病毒分离与鉴定 采集的6株2009-2014流感样标本，感染MDCK细胞3 d 左右后，CPE达到三个+时，收集细胞上清液进行实时荧光PCR进行H1N1亚型的确认。

2.2 HA序列测定与拼接 采用WHO提供的HA测序引物扩增的PCR产物进行测序，序列的拼接采用BioEdit生物软件，并用MEGA 4.0进行进化树分析。

2.3 HA基因进化树分析 6株H1N1流感病毒的HA基因核苷酸序列系统进化树分四个簇，见图1。其中福州地区流行的H1N1病毒的核苷酸序列主要来源于禽流感和季节性流感H1并与猪流感病毒重组形成新的H1N1流感病毒株，本次筛选的6株甲型H1N1分离株核苷酸序列之间的同源在98%以上，进一步表明这6株病原体均来自同一簇，其中2009年度分离的病毒株与标准株A/California/07/2009（H1N1）亲缘关系较近，而2010-2014年在同一个分支，距离相对较远。

2.4 分离株HA1基因片段的氨基酸序列分析 HA蛋白由HA1（326个氨基酸）和HA2（223个氨基酸）两部分组成，主要抗原决定簇是在HA1区，A/California/07/2009（H1N1）是一个国际代表株。HA1基因片段发生了16个点突变，其中在A区有2个氨基酸位点发生变化，分别为136（K>H）和145（R>K），抗原决定簇B区有4个氨基酸位点发生变化，分别为188（K>M）和189（T>A），192（H>D/N）和193（K>T），分离株有多处氨基酸发生替换，氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。另外，糖基化方面保留了古典猪H1N1的特点。见图2。

3 讨论

2009-2014年流感样病例分析表明，福州地区的流感病毒主要流行的亚型为B型，而甲型H1N1和H3亚型分别占有一定比例，这个结果和福建省的监测结果一致。文献[6]进一步分析福州地区流行的甲型H1N1流感毒株与在全国范围内主要流行株的同源性，并进一步确认所在的哪一个簇。流感病毒的HA基因作为流感病毒主要表面抗原之一，其遗传基因进化表现出强的活跃性，同时也是流感病毒发生抗原漂移和分子变异的基础，其中HA1蛋白是病毒与细胞结合受体的关键[7-9]。相对于HA2蛋白，HA1蛋白承受着更大的免疫选择压力，因此HA1基因的变异直接影响流感病毒抗原的漂移[3-4，10]。随着流感疫苗的接种人员扩大，并根据世界卫生组织的推荐疫苗进行接种，人群的免疫能力增强，然而流感病毒发生抗原漂移的可能性也随之加大[11]。从统计学意义上，要确认发生抗原漂移，至少需要需要再HA1区上有4个以上氨基酸发生了突变，而且其中有3个是在抗原决定簇上[10，12-13]。6株分离株的HA氨基酸序列与参考株A/California/04/2009相比，2009-2014年HA1区分别有4、4、5、4个氨基酸发生了突变，主要是位于136、145、188、189、192和193位，福州地区H1N1流感的HA基因序列与世界流行的病毒参考株具有高度同源性，并发现多个的氨基酸发生点突变，确认为抗原性漂移[12，14]。

从HA基因进化树分析结果显示，

A/California/07/2009（H1N1）与福州2009年的分离毒株和疫苗株亲缘关系较近，但是和2010-2014年的流感病毒株分别处于不同的分支，其亲缘关系较远。因此，从基因特性分析可以推测到，近6年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年大连市H1N1亚型流感预防效果较理想[11，15]。

此次流行的甲型H1N1流感病毒，主要是由于流感病毒的抗原性发生变异，尤其是HA1区的抗原决定簇[2，16]，其次是由于中国对猪群流感病毒的检测和流行并没有较好的监测系统，从而导致在猪群中引起流感大暴发的病毒和人或禽的流感进行重组，而不能被及时发现和预测、预警[17]，不同亚型的病毒有可能在不同种属的动物呼吸道上皮细胞上进行基因重组[18]。所以，应在世界卫生组织全球范围内加强对甲型H1N1流感病毒监测，同时对可能是基因重组的流感病毒株进行病毒全基因组序测序，进而分析病毒基因突变的现状并为流感疫苗的研制做准备[15，19-20]，使得流感疫苗能更好地防控流感流行，并為流行趋势的改变制定防控方案提供病原学科学依据。

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（收稿日期：2016-12-08） （本文编辑：周亚杰）