木薯MeCWINV4启动子的克隆及其活性分析

耿彬彬+刘姣+郭育强+符少萍+胡新文+郭建春

摘要：根据木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4已知编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeCWINV4基因序列信息设计引物，从木薯基因组DNA中对该基因的潜在启动子区进行PCR扩增，经测序比对成功获得1 639 bp序列，其中包含74 bp编码区序列和1 565 bp潜在启动子区序列。用PlantCARE和PLACE软件分析该序列的顺式作用元件，发现该启动子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反应相关元件与应对高低温胁迫和激素响应相关元件。将MeCWINV4启动子片段取代pVKH表达载体中的CaMV 35S 启动子与 GUS 连接，构建成融合表达载体 pVKH-CW4-GUS，通过农杆菌真空渗透法在烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明，该启动子驱动了GUS基因在烟草叶片中的表达。说明MeCWINV4启动子具有启动子活性，可以启动目的基因的转录，为进一步研究该基因的调控机制奠定了基础。

关键词：木薯；MeCWINV4；启动子；序列分析；瞬时表达

中图分类号： S533.01；Q785

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0036-05

木薯（Manihot esculenta Crantz）属大戟科木薯属，为多年生植物，广泛栽培于热带和部分亚热带地区，块根富含淀粉，可供食用或用于生产乙醇，是全球近6亿人的主要粮食来源[1]，也是中国推广的可再生能源作物和重要的工业淀粉原料[2]。

木薯块根淀粉是由源器官（叶片）通过光合作用制造的光合产物，以蔗糖的形式经韧皮部装载、长距离运输和卸载运送到库器官 （块根），然后在块根中由淀粉合成相关酶催化合成淀粉[3]。但是，木薯块根中积累的淀粉量远远低于理论产量，地下部分储藏的碳水同化物还不足地上部分合成同化物的1/5，提高同化物从源到库的运输效率对增加木薯块根淀粉的积累至关重要。而在木薯淀粉合成积累过程中，对光合产物由“源”到“库”的装载、运输和卸载中起主要调控作用的是蔗糖转化酶。蔗糖转化酶参与了叶片光合作用的调节、韧皮部的卸载和库的建立、贮藏器官中碳水化合物的积累和组成以及细胞对胁迫的响应，并在逆境中起一定作用。蔗糖转化酶根据其亚细胞定位，可以分为细胞质转化酶、液泡转化酶以及细胞壁转化酶[4]。其中，细胞壁转化酶主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以保持源—库之间蔗糖的浓度梯度，从而促使蔗糖顺利卸载[5]。笔者所在课题组研究发现木薯中存在6个细胞壁转化酶基因，对这些转化酶基因进行克隆并在木薯各器官中的表达模式进行分析，发现其中的细胞壁转化酶MeCWINV4在叶片中表达微弱，但在块根韧皮部中表达量相对较高[6]。由此推测，MeCWINV4基因在块根韧皮部的组织差异性高表达可能提示该基因在木薯淀粉合成过程中同化物从源到库运输时的韧皮部卸载起着很重要的作用。

基因的表达调控，在植物的生长发育以及应答环境信号过程中起重要作用[7]。启动子在调控基因转录的起始及表达程度中起着关键作用。研究启动子的功能序列及其调控元件对解析基因表达调控的机制具有十分重要的意义[8]。

本研究根据已知木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4编码区序列与木薯基因组数据库预测信息克隆木薯细胞壁转化酶基因家族中的MeCWINV4启动子序列，通过生物信息学分析软件对其上的顺式作用元件进行初步分析，构建植物表达载体，利用农杆菌真空渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，初步鉴定该启动子的活性。为后续深入研究木薯细胞壁转化酶基因启动子对该基因在淀粉积累过程中的调控作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料华南8号木薯与三生烟（Nicotiana tabacum var. samsun NN），采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所试验基地；大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101和含有GUS基因的植物表达载体pVKH-35S-GUS由笔者所在课题组保存。各种工具酶、Marker购自TaKaRa公司；回收纯化试剂盒、生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 木薯基因组DNA提取 采用SDS法[9]提取华南8号木薯组培苗幼苗基因组DNA，取适量DNA用于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 MeCWINV4启动子的克隆及序列分析 根据已知木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4编码区序列（GenBank ID：JQ792172）与木薯基因组数据库（http：//www.phytozome.net/cassava）中预测的MeCWINV4基因序列信息设计引物。引物序列如下：CW4p-F，GAAAAGGCATCGTCACCATT；CW4P-R，TCAAGCTCAAACACTCCAT。以木薯DNA为模板进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃充分延伸 10 min。扩增反应结束后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，再用DNA回收试剂盒纯化目的片段，然后将回收产物连接到pMD-19 T-vector simple载体上，通过转化、筛选、菌液PCR，获得阳性单克隆命名为CW4p-19T。CW4p-19T热激转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。测序结果用DNAMAN软件进行比对，比对正确的序列用PlantCARE和PLACE软件分析该启动子序列，在线预测顺式作用元件。

1.2.3 植物表达载体pVKH-CW4-GUS的构建 将测序正确的菌液扩大培养提取质粒，以该质粒为模板，添加酶切位点（正向引物中添加SacⅠ酶切位点，反向引物中添加 BamHⅠ 酶切位点）的特异引物（CW4-1F：TAGAGCTCGAAAAGGCATCGTCAC；CW4-1R：TAGGATCCGCTGGTGAGTGCATGT）进行PCR扩增（下划线为酶切位点）。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小正确后，将目的片段纯化回收后与表达载体pVKH均进行Sac Ⅰ和BamHⅠ双酶切、纯化回收，采用T4 DNA连接酶连接，使MeCWINV4启动子区段定向替换pVKH载体上的CaMV35S启动子。将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆，菌液PCR和双酶切双重鉴定后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进一步测序验证正确后，获得重组质粒命名为pVKH-CW4-GUS。本试验以空载体pVKH-35S-GUS作为阳性对照。

1.2.4 农杆菌介导的烟草瞬时表达 采用反复冻融法[10]将空载体pVKH-35S-GUS和pVKH-CW4-GUS重组质粒分别转化农杆菌GV3101感受态细胞中，在YEP（1% Yeast Extract、1% Tryptone、0.5% NaCl）+Kana（100 μg/mL）+Rif（50 μg/mL）固体培养基上28 ℃培养2 d，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性菌株，在50 mL YEP液体培养基中扩大培养。待D600 nm=0.8～1.0时，5 000 r/min离心 5 min 收集菌体，用含10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS（乙酰丁香酮）和10 mmol/L MES（pH值=5.6）的无菌水重悬至D600 nm约为1.0，室温静置2 h后备用。用打孔器将烟草叶片打出大小一致的圆形叶盘，浸泡在菌悬液中，然后在真空泵中抽滤30 min，压强不超过0.085 MPa，取出后平铺到含有浸湿滤纸的培养皿中，置于25 ℃培养箱中培养3 d。

1.2.5 GUS活性的组织化学染色分析 将侵染后的烟草叶片置于GUS染液[2 mmol/L X-Gluc，5 mmol/L K3Fe（CN）6，100 mmol/L Na3PO4 缓冲液（pH值=7.0），5 mmol/L K4Fe（CN）6，0.2% Triton X-100，10 mmol/L EDTA]中，确保浸没叶片，37 ℃ 避光保温3 d，用70%乙醇进行脱色后拍照。

2 结果与分析

2.1 MeCWINV4启动子的克隆

经琼脂糖电泳检测后提取的DNA质量较好，可用于后续PCR试验（图1）。根据设计的引物从DNA中扩增得到1段长约1 800 bp的DNA片段，测序分析该片段为1 639 bp的序列（图2）。CW4p-19T测序后经Blast比对发现，该片段含有的MeCWINV4基因是从ATG起始的74 bp编码区序列和ATG上游1 565 bp潜在启动子序列，且该74 bp编码区片段与笔者所在的课题组之前克隆的MeCWINV4基因（Accesion NO.JQ792172）相对应的全长编码区序列同源性达100%，表明所克隆到的序列为MeCWINV4的启动子序列，序列数据提交给GenBank，登录号为KP164867。

2.2 MeCWINV4 启动子序列的生物信息学分析

将克隆到的MeCWINV4启动子序列用PlantCARE和PLACE在线软件进行元件预测分析，分析结果见图3、表1，结果显示，MeCWINV4启动子不仅含有CAAT box和TATA box保守元件，还存在多种与光反应和非生物胁迫相关的顺

式作用元件。（1）光响应元件。Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1。（2）胁迫应答元件。高温响应元件HSE，低温响应元件LTR，干旱诱导相关元件MBS，胁迫防御元件TC-rich repeats。（3）激素应答元件。脱落酸响应元件ABRE，水杨酸响应元件SARE，赤霉素响应元件GARE-motif，生长素响应元件TGA-element等。

2.3 MeCWINV4启动子融合表达载体的构建

2.4 MeCWINV4启动子活性分析

重组载体pVKH-CW4-GUS和空载体pVKH-35S-GUS分别转化农杆菌后，进行瞬时表达分析。结果显示，pVKH-CW4-GUS和pVKH-35S-GUS在烟草叶片中都能驱动GUS基因的表达，烟草叶片被染成蓝色，而阴性对照不能被染色（图6）。

3 结论与讨论

高等植物中，蔗糖是光合同化物运输的主要形式[11]，木薯韧皮部筛管内的糖类80%为蔗糖，木薯源器官（叶片）光合作用合成的同化物经过韧皮部装载-运输-卸载到库器官（块根）形成淀粉。蔗糖转化酶中细胞壁转化酶是植物源库器官蔗糖代谢的关键酶，不可逆地将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，保持源—库之间蔗糖的浓度梯度，调节蔗糖从叶中运出的速率来进行源库关系的建立及调控[12-14]。同时有研究发现，当植物受到生物和非生物胁迫时，细胞壁转化酶基因被激活或增强表达，参与一系列防御反应。拟南芥根部被病原菌侵染后，根内细胞壁转化酶基因表达量升高，更多的蔗糖运输到侵染部位，为根细胞抵御病原菌侵染提供碳水化合物[15]。Sonnewald等研究发现，当病原菌侵染胡椒叶片后，细胞壁转化酶基因表达及活性提高，己糖信号形成，诱导病程相关蛋白（PR）基因表达，增强叶片对病原菌的防御力[16]。同时发现，伤害胁迫[17]、诱导子[18]、病原菌侵染[19]和己糖[20]诱导细胞壁转化酶基因的表达，乙烯则抑制其表达[21]。

基因在生物生长发育过程中根据生物自身和环境定时、定位、定量地特意表达，很大程度上是通过DNA顺式作用元

件与反式作用因子或环境中光、热、胁迫等因素的互作来实现的。其中，启动子的作用尤为关键[22]。转化酶基因能够被多种胁迫信号诱导表达，可能是由于这些基因的启动子序列中存在与逆境诱导相关、参与基因转录调控的顺式作用元件[23]。牛俊奇等发现，甘蔗酸性转化酶基因SoSAI1上游 417 bp 启动子中含有参与干旱诱导的MYB结合位点，15%PEG胁迫能诱导甘蔗苗期根和叶片中SoSAIⅠ的表达[23]；成善汉等研究发现，通过低温处理，诱导了马铃薯启动子CIP调控转化酶抑制子St-VIF基因表达的上调，从而抑制转化酶的活性[24]。在烟草[25]、拟南芥[26]、大豆[27]等植物中也得到了同样的验证。

本试验克隆获得的木薯细胞壁转化酶MeCWINV4基因的1 639 bp启动子除含有CAAT box和TATA box等真核生物启动子基本元件外，还存在大量光反应元件如Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1，说明MeCWINV4基因的表达受到光的调控，能更高效地在木薯淀粉积累过程中发挥作用。同时该启动子上也存在多个胁迫应答元件（高温响应元件HSE、低温响应元件LTR、干旱诱导相关元件MBS、胁迫防御元件TC-rich repeats）和激素应答元件（脱落酸响应元件ABRE，水杨酸响应元件SARE，赤霉素响应元件GARE-motif，生长素响应元件TGA-element），暗示该基因的表达可能受到多种逆境胁迫和激素的调控。MeCWINV4启动子上这些顺式作用元件的预测结果可以为后续的酵母单杂交试验提供理论依据，也为了解该基因的调控模式、信号传递途径、生物适应环境机制提供理论基础。

烟草瞬时表达试验证明了所克隆的MeCWINV4启动子能够启动GUS报告基因的表达，具有启动子活性。瞬时表达虽然不受基因沉默和基因位置效应的影响且转化率高，但为了进一步研究MeCWINV4启动子的组织表达特性和调控基因表达模式，还须通过进一步稳定表达试验进行元件缺失分析和不同诱导条件下该基因及其该启动子活性变化，更深入地分析该基因启动子活性，目前相关工作正在进行中。

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