CD3E蛋白真核表达及全人源CD3单克隆抗体的制备①

杨 希 郎巧利 黄 楠 余 琳 吴 梦 葛良鹏

(重庆市畜牧科学院，重庆市医用动物资源的开发与利用工程技术研究中心,重庆 402460)

T淋巴细胞是免疫系统的重要组成成分，具有直接杀伤靶细胞的功能，能对特异性抗原产生免疫应答反应并分泌细胞因子[1-4]。CD3是T淋巴细胞表面重要的标志蛋白，能与T细胞表面受体(T-cell receptor,TCR)形成CD3/TCR复合物，从而介导T淋巴细胞识别抗原和信号[5]。在CD3/TCR复合物中，TCR的基因在表达过程中发生重排，其序列是多变的，而CD3蛋白是保守的，不是抗原特异性的[6]。CD3蛋白是参与细胞的信号传导、分化、增殖及发挥效应功能的主要物质基础，CD3抗体能够阻断或激发T细胞活化。世界上第一个CD3抗体OKT3(ortho Kung T3,murine IgG2a)能与T淋巴细胞表面CD3蛋白结合从而阻断T细胞活化，起到免疫抑制作用，在早期被用于治疗肾移植中的同种异体排斥反应[7,8]。然而鼠CD3抗体对人体是异源蛋白，应用于人体时可引起人抗鼠抗体反应(HAMA)，可加快人体对鼠源抗体的清除从而阻断抗体治疗效果，也可诱导变态反应发生危及生命，其毒副作用极大地限制了其临床使用和推广[9,10]。Kimball等[11]收集30例心脏、30例肾脏和30例肝脏移植受者270份血清，这些受者之前没有接触过小鼠OKT3，但接受小鼠OKT3诱导免疫抑制治疗。研究发现几乎所有血清中均具有较高滴度的人抗OKT3的IgG抗体。Chatenoud等[12]发现OKT3小鼠单克隆抗体在人体内发生强烈的人抗小鼠抗体反应，严重影响了OKT3治疗效果。随后，许多研究者将CD3鼠抗人源化处理，获得了众多的人源化CD3抗体，包括teplizumab (huOKT3γ1)[13-15],otelixizumab[16,17](aglycosylated rat YTH12.5)和visilizumab[18,19](HuM 291)。人源化改造极大程度地减少了HAMA反应，增加了抗体的耐受性。然而这些人为的修改仍然不能完全消除异种蛋白潜在的风险[20]，全人源抗体是抗体产业发展的重点方向。

CD3蛋白空间结构复杂，由CD3γ、CD3δ、CD3ε(CD3E)、CD3ζ、CD3η五种肽链组成。其中CD3E包含1个免疫球蛋白样亚基和1个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，是CD3蛋白重要组成部分，缺失CD3E基因会导致机体严重的免疫缺陷，是CD3抗体常用的蛋白靶点[21-24]。本研究拟根据人CD3E基因序列，构建表达CD3E胞外区的重组表达质粒，通过293F悬浮细胞表达系统表达并纯化获得CD3E蛋白，免疫人抗体转基因小鼠CAMouse-HG76，通过细胞融合和抗体筛选制备针对人CD3的全人源单克隆抗体，为后续建立CD3蛋白的ELISA检测方法、开发全人源CD3治疗性抗体药物及相关研究提供基础。

1 材料与方法

1.1材料 质粒pcDNA3.4购自Invitrogen公司；293F细胞购自北京诺进生物技术有限公司；细胞用耗材(除特殊说明)均购自CORNING公司；EasyPure HiPure Plasmid MaxiPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司；E.coliDH5α Competent Cells购自宝日医生物技术(北京)有限公司；TransCult LB Agar Plate (Ampicillin) 培养皿购自北京全式金生物技术有限公司；Opti-MEM培养液购自美国Gibico公司；HITRAP PROTEIN G HP购自GE公司；人抗体转基因小鼠CAMouse-HG76购自重庆金迈博生物科技有限公司；Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein购自ACROBiosystems公司；Mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)购自南京金斯瑞生物科技有限公司；Ficoll Paque PLUS购自GE公司；Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) preadsorbed (ab7064)购自Abcam公司；PBST购自Solarbio公司；弗氏佐剂(弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、谷氨酰胺、PEI(聚乙烯亚胺)购自Sigma；ClonaCellTM-HY Hybridoma Kit购自STEMCELL Technologies公司；Human CD3 (huma-nized OKT3) Antibody-Human IgG4 (GMP-grade)、293F细胞基础培养液购自北京义翘神州生物技术有限公司；SDS-PAGE(NuPAGETM10% Bis-Tris Protein Gels)购自Invitrogen公司； His-probe antibody (H-3):sc-8036 Alexa Fluor®680购自Santa Cruz Biotechno-logy公司。

1.2方法

1.2.1CD3E蛋白真核表达纯化

1.2.1.1表达载体的构建 本实验参照CD3E基因(Gene ID:916)的DNA序列信息，体外合成其胞外区序列，同时在其末端加入mouse IgG2 Fc和6×His(Fc标签用于纯化，His标签用于Western blot鉴定)，再通过EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点连接入真核表达载体pcDNA3.4中获得重组质粒pcDNA3.4-CD3E-mFc。

1.2.1.2质粒的大量提取与鉴定 按照E.coliDH5α Competent Cells使用说明书，将10 ng重组质粒DNA加入到冰上融化的感受态细胞中后冰上放置30 min，42℃热激45 s，再在冰上放置1 min，加入已经预热到37℃的SOC培养液到1 ml，37℃震荡培养1 h。将培养好的菌液取100 μl涂布TransCult LB Agar Plate (Ampicillin) 培养皿，于37℃培养箱中静置培养12～18 h。

1.2.1.3293F细胞转染 取对数生长期的293F细胞按照0.8×106cells/ml密度进行传代。第二天，待细胞长到1.5×106cells/ml，并且细胞活率大于95%后，将细胞稀释到1×106cells/ml后进行转染。

取2个无菌的2 ml EP管，一个加入200 μl Opti-MEM 293F基础培养液和20 μg 重组质粒DNA(浓度为1.5 mg/ml)，另一个加入200 μl Opti-MEM 293F基础培养液和60 μl PEI(1 μg/μl)，各自混匀后室温孵育 5 min。再将混匀的PEI溶液快速加入混匀的重组质粒DNA中，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育15 min，再逐滴加入准备好的293F细胞中，边加边轻轻振荡细胞。将转染好的细胞置于震动培养箱中培养，每天用台盼蓝染色法计算细胞活率，当活细胞量下降至60%左右时，400 g离心20 min收取细胞上清液。

1.2.1.4蛋白纯化 利用HITRAP PROTEIN G HP进行上清中蛋白的纯化。先用5倍柱体积的超纯水冲洗柱子，再用5倍柱体积的结合缓冲液(20 mmol/L PB buffer，0.2 mol/L NaCl，pH=7.2)平衡柱子。将收集的细胞上清用0.45 μm滤膜过滤后与等体积的结合缓冲液混合，再上样，流速为1 ml/min，收集流穿液。用10倍柱体积的结合缓冲液洗柱子，直到紫外和电导均为基线。用洗脱缓冲液(100 mmol/L 甘氨酸，pH=2.7)洗脱至中和缓冲液(1 mol/L Tris-HCl，pH=9.0)中，流速1 ml/min。洗脱后立即用10倍柱体积的结合缓冲液重新平衡柱子。再将纯化后的蛋白用PBS透析过夜后用超滤管浓缩并调整浓度至2 mg/ml。

1.2.1.5SDS-PAGE和Western blot 将获得的蛋白取10 μl进行SDS-PAGE，并通过电转将蛋白转至PVDF膜上；用1.5%的脱脂奶粉封闭，室温孵育1.5 h；弃封闭液，加入稀释好的抗体His-probe antibody (H-3):sc-8036 Alexa Fluor®680(1∶1 000稀释)，室温孵育2 h；用TBST缓冲液洗涤3～5次，3～5 min/次；用Odyssey双色红外荧光成像系统成像。

1.2.2单克隆抗体制备

1.2.2.1免疫小鼠 以弗氏佐剂作为佐剂，按照说明书，每间隔2周免疫1次，每次免疫后第7天采血检测血清效价。细胞融合前3 d取200 μg/只的蛋白直接进行脾脏加强免疫。

1.2.2.2血清效价检测 Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein以0.5 μg/ml包被于ELISA板中，4℃孵育过夜；用PBST洗3次，加入1%BSA封闭2 h； PBST洗3次，加入倍比稀释的血清(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800)(同时设置未免疫小鼠血清作为阴性对照)，室温孵育1 h；PBST洗3次，加入1∶5 000稀释的mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)，室温孵育1 h；PBST洗3次后，加入TMB进行显色20 min；加入2 mol/L硫酸溶液终止，用酶标仪读取OD450 nm值。以大于2.1倍阴性值作为阳性。

1.2.2.3细胞融合 细胞融合前3 d取200 μg/只的蛋白直接进行脾脏加强免疫。颈椎脱臼法快速处死免疫小鼠，分离其脾脏淋巴细胞。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5 混合后通过微纳秒复合脉冲电融合法进行细胞融合，设置纳秒融合参数为10 KV/cm、200 ns、8次，微秒融合参数为2.5 KV/cm、20 μs、1次。将融合细胞按照ClonaCellTM-HY Hybridoma Kit在半固体培养基中进行培养并且单克隆化。当培养10～14 d后，肉眼可见单个克隆，用10 μl枪头挑单个克隆于新的铺满滋养层细胞的96孔板中进行培养，2～3 d培养液颜色变黄以后，吸出上清做ELISA检测和流式分析。

1.2.2.4ELISA筛选 Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein以0.5 μg/ml包被于ELISA板中，4℃孵育过夜；用PBST洗3次，加入1%BSA封闭2 h；PBST洗3次，加入杂交瘤上清，室温孵育1 h；PBST洗3次，加入1∶5 000稀释的Mouse Anti-Human IgG Fab Monoclonal Secondary Antibody (A01855)，室温孵育1 h；PBST洗3次后，加入TMB进行显色20 min；加入2 mol/L硫酸溶液终止，用酶标仪读取OD450 nm值。

1.2.2.5杂交瘤细胞株的流式检测 按照人淋巴细胞分离液Ficoll Paque PLUS使用说明书分离人PBMC，调整细胞浓度为2×105cells/200 μl用于后续实验。取200 μl的PBMC加入100 μl杂交瘤上清或同型非相关杂交瘤抗体上清(本实验室保留)，4℃孵育30 min；用含2%FBS的PBS缓冲液清洗细胞2次；加入Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) preadsorbed (ab7064)(1∶1 000稀释)；用含2%FBS的PBS缓冲液清洗细胞3次；每个样品加入400 μl 2%FCS PBS缓冲液，混匀，用于流式细胞仪上样检测。

2 结果

2.1人CD3E表达载体的鉴定 如图1所示，将获得的重组表达质粒pcDNA3.4-CD3E-mFc用Bglll限制性内切酶酶切后，获得4 182 bp和2 924 bp的两条带，与预期相符。

2.2人CD3E-mFc蛋白真核表达及纯化 转染当天细胞活率为99%(转染当天计为第0天)，转染后第9天细胞活率下降至59%，停止培养，离心收集细胞上清。用Protein G柱纯化后，进行SDS-PAGE和Western blot分析。如图2、3所示，CD3E-mFc蛋白理论大小为39.4 kD，但是CD3E蛋白存在多个糖基化位点，其实际表达的蛋白要略大。SDS-PAGE结果显示，CD3E-mFc蛋白约为85%，可以用于后续小鼠免疫。

2.3CAMouse-HG免疫效果检测 以纯化后的CD3E-mFc蛋白作为抗原免疫CAMouse-HG76小鼠，第6次免疫后第7天采血，使用ELISA法检测血清中抗体的效价。如图4所示，以OD450 nm值大于2.1倍阴性值(未免疫鼠)为阳性判定标准，则4394#、4401#、4403#效价为1∶102 400，4404#效价为1∶51 200，4396#、4397#、4400#效价为1∶25 600。

2.5ELISA法筛选单克隆抗体 选取4394#小鼠进行细胞融合实验(其余小鼠用于其他实验)。杂交瘤细胞上清用ELISA法检测筛选，以OD450 nm值大于2.1倍阴性值(同型非相关杂交瘤抗体上清)为阳性判定标准。ELSIA结果表明，阴性对照平均OD450 nm=0.099，OD450 nm≥2的有22个克隆，2>OD450 nm≥1的有23个克隆，1>OD450 nm≥0.5的有39个克隆，0.5>OD450 nm≥0.21的有39个克隆。因此ELISA筛选共获得140个阳性克隆。

图1 pcDNA3.4-CD3E-mFc酶切鉴定图Fig.1 Restriction enzyme analysis of pcDNA3.4-CD3E-mFcNote: M.DL10 000 marker;1.Bglll mono-enzyme digestion of pcDNA3.4-CD3E.

图2 SDS-PAGE结果Fig.2 Results of SDS-PAGENote: M.Blue plus IV protein marker (10-180 kD)；1.Supernatant solution of transfected 293F cells；2.Washing product；3.Elution product.

2.6ELISA法筛选单克隆抗体 将ELISA筛选获得的阳性克隆的细胞上清做流式细胞分析，结果表明(图5)筛选获得了3个能与细胞表面CD3结合的抗体：20-2G、41-2B、57-12E。

图3 Western blot结果Fig.3 Results of Western blotNote: M.Blue plus IV protein marker (10-180 kD)；1.Supernatant solution of transfected 293F cells；2.Flowing fluid;3.Washing product；4.Elution product.

图4 ELISA检测CAMouse-HG76血清抗体效价Fig.4 Antibody titers of CAMouse-HG76 sera detected by ELISA

图5 杂交瘤上清流式细胞分析Fig.5 FACS analysis of hybridoma supernatant

3 讨论

CD3抗体在生物医药领域具有极其广阔的应用前景。临床前研究表明，口服抗CD3单克隆抗体是一种有效的全身免疫调节方法，可以在不消耗T细胞的情况下减轻免疫介导的疾病。Ilan等[20]综合评价了口服CD3单克隆抗体在治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的重要作用。人体试验表明，在健康志愿者、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者、NASH和2型糖尿病患者中口服抗CD3药物是安全的、耐受性良好的，并且具有生物活性。口服抗CD3诱导调节性T细胞，抑制与NASH相关的慢性炎症状态，对临床相关参数发挥有益作用。同时CD3也可用于介导T细胞对靶细胞的识别杀伤作用。B7同源蛋白4 (B7-h4)是一种免疫检查点分子，负调控免疫反应，已知在许多人类癌症中过表达。Iizuka等[21]设计获得了一种B7-H4/CD3双特异性抗体，该抗体在体外和体内实验中均显现出强抗肿瘤活性，可能是B7-H4蛋白阳性乳腺癌的良好治疗工具。Ma等[22]构建了B7-H3/CD3双特异性抗体，发现该抗体可以特异性的抑制B7-H3蛋白阳性肿瘤生长。与此同时，CD3抗体也常和免疫抑制性抗体组合作战，增强疗效[24]。CD47是肿瘤细胞逃逸巨噬细胞识别，从而逃避免疫系统攻击的表面膜蛋白。Xu等[23]利用CD47抗体和CD19/CD3双功能抗体联合使用，使淋巴瘤得到持续控制，从而增强了治疗效果。PD-1(程序性死亡受体-1)是表达在T细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白。肿瘤细胞能够表达其配体PD-L1或PD-L2，当配体与PD-1结合后，T细胞就不能够发现肿瘤，不能发出攻击肿瘤信号[25,26]。Horn等[27]设计了一种PD-1/CD3双功能抗体，可以激活T细胞，同时也对PD-L1阳性肿瘤细胞具有显著细胞毒性。在体内实验中，PD-1/CD3也显现出显著的肿瘤杀伤活性。

CD3是一个有多条肽链组成的多聚蛋白，本研究选择了其中具有重要生物活性的CD3E作为靶点。CD3E中含有多个糖基化位点，本研究选择通过293F表达系统表达该蛋白的胞外区域。293F细胞是从HEK293(人胚肾细胞)中分离出的一种能够在无血清培养液中高密度培养的悬浮细胞，转染效率非常高，即使用价格便宜的PEI配制的试剂进行转染也可以获得高产量的蛋白，并且表达蛋白结构接近人体内构象。为了便于后期纯化，本研究在CD3E末端连接了小鼠Fc区域进行融合表达CD3E-Fc蛋白，其理论值大小为39.4 kD，而SDS-PAGE和Western blot结果发现，实际值略偏大(约43 kD左右)，这可能是CD3E蛋白存在多个糖基化位点所导致的。

CD3E是一种人蛋白，许多研究是通过与人Fc融合促进其表达和纯化，本研究选择小鼠的Fc进行融合表达，一方面可以促进CD3E的表达和纯化，同时在后期免疫小鼠时，小鼠Fc蛋白在小鼠体内免疫原性极低，使小鼠产生大量的只针对CD3E的抗体。

为了获得全人源CD3抗体，本研究选择中国自主知识产权的人抗体转基因小鼠CAMmouse-HG76品系。用表达的CD3E-mFc蛋白免疫该小鼠血清效价高达1∶102 400，可用于后续的细胞融合实验。

由于人CD3蛋白结构的特殊性和复杂性，获得人CD3抗体非常困难。CD3是一个多聚膜蛋白，拥有多条肽链，目前在体外无法获得其天然折叠状态的CD3蛋白。在杂交瘤的ELISA筛选中，本研究选择了目前最为接近CD3蛋白的Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein，其与CD3抗体SP34-2和OKT3均具有良好的浓度依赖的结合活性[27]。本研究以OD450 nm值大于2.1倍阴性值(同型非相关杂交瘤抗体上清)为阳性判定标准，共筛选获得140个阳性克隆。为了进一步检测抗体与天然CD3的结合活性，本实验分离了人外周血单核细胞进行流式细胞分析，结果显示只有20-2G、41-2B、57-12E这三个抗体具有结合活性。这说明筛选所用的蛋白Human CD3 epsilon & CD3 delta Heterodimer Protein与天然CD3蛋白的结构仍具有显著的差异。

本研究在体外利用真核表达系统表达并纯化获得了人CD3E蛋白胞外区，免疫人源化抗体转基因小鼠，细胞融合后通过ELISA检测和流式细胞分析成功筛选获得了3株CD3单克隆抗体，为后续建立CD3蛋白的ELISA检测方法、开发全人源CD3治疗性抗体药物及相关研究提供基础。