UVRAG调控金黄色葡萄球菌诱导的细胞自噬及其细菌的胞内存活①

杨 彬 王郅杰 么宏强 邓天健 额尔敦木图 (内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018)

自噬可以保护细胞免受细胞内病原体的侵袭，但是自噬也可以被病原体利用以利于其存活[3]。细胞内感染SA后，SA能够破坏自噬体并逃逸到宿主细胞的细胞质，并且抑制吞噬体与溶酶体的融合，此外，药物诱导的自噬促进细胞内SA的复制[4，5]。

研究发现紫外线抵抗相关基因(UV radiation resistance-associated gene,UVRAG)能够与Beclin1等形成复合体从而促进自噬[6]。A群链球菌在内化、入侵宿主细胞过程中能够通过某些分子(如NOD样受体NLRX1)与Beclin1-UVRAG复合体相互作用，从而影响A群链球菌诱导的自噬及其侵入[7]。研究发现Bcl-xL通过与Beclin1-UVRAG相互作用抑制A群链球菌的内化[8]。近期研究发现UVRAG被SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)泛素化能够增强自噬的成熟[9]。国内研究人员发现UVRAG与白血病的恶性进展有关[10]。同时有研究显示UVRAG参与了肝脏的脂肪变性[11]。可见，UVRAG的研究已成为一个热点课题。然而，UVRAG能否调控SA诱导的自噬及其在胞内的存活目前尚未见报道。因此，本研究通过SA刺激HeLa细胞建立体外感染模型，从细胞水平探讨UVRAG对SA诱导HeLa细胞自噬及胞内菌存活的影响。

1 材料与方法

1.1材料 HeLa细胞由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院张华教授惠赠；金黄色葡萄球菌ATCC29213由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院陈志宝教授惠赠；pCI-neo质粒由黑龙江八一农垦大学动物科技学院周玉龙副教授惠赠；pCI-neo-HA-hUVRAG质粒、EGFP-LC3质粒购自Addgene公司；LipofectamineTM3000转染试剂购自Invitrogen公司；人UVRAG小干扰RNA由上海吉玛公司合成；兔多克隆抗体LC3B购自Novus公司；小鼠单克隆抗体p62、兔多克隆抗体UVRAG、小鼠单克隆抗体GAPDH均购自Abcam公司；兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体购自北京博奥森生物技术公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的兔抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物公司； RBITC标记的山羊抗兔IgG购自北京索莱宝生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HeLa细胞加入含有10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 0.5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2UVRAG的RNA干扰及过表达 将HeLa细胞在转染前一天接种于细胞培养板中，按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行转染，干扰UVRAG试验分为对照组和UVRAG siRNA干扰组；过表达UVRAG试验分为对照组(转染pCI-neo质粒)和过表达UVRAG组(转染pCI-neo-HA-hUVRAG质粒)。

1.2.3SA感染细胞 将SA(MOI=100)分别与HeLa细胞共培养1.5 h后，加入含有庆大霉素(100 μg/ml)的细胞培养液共培养30 min杀死胞外菌，更换培养液继续分别培养HeLa细胞1、2、3、4、5 h，收集细胞后Western blot法检测LC3B、p62及UVRAG的表达水平。

用上述同样的感染方法将SA(MOI=100)分别感染干扰及过表达UVRAG的HeLa细胞1、2、3、4、5 h，收集细胞后Western blot法检测LC3B、p62及UVRAG的表达水平。

1.2.4Western blot法检测LC3B、p62及UVRAG的蛋白表达水平 裂解液RIPA裂解并提取各组细胞蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度，将蛋白煮沸变性后进行SDS-PAGE分离，电泳后将蛋白进行转膜，分别用1∶1 000稀释的LC3B、p62、UVRAG及GAPDH抗体进行过夜孵育，用1∶5 000稀释的HRP标记的二抗孵育1 h，漂洗后进行ECL显色，凝胶成像系统显影后用Quantity One软件进行灰度分析。

原译：During the Yongzheng reign,the nine-peaches design was commonly seen on the famille-rose ware such as globular vases,olive-shaped vases and plates are decorated with branches that extend from the outside into the bowl.

1.2.5激光共聚焦显微镜观察 将EGFP-LC3质粒及pCI-neo-HA-hUVRAG质粒用LipofectamineTM3000转染试剂共转染HeLa细胞，对照组将EGFP-LC3质粒及pCI-neo质粒共转染HeLa细胞，转染24 h后用SA感染，3 h后多聚甲醛固定细胞，用TritonX-100穿孔后封闭，加入1∶100稀释的抗SA抗体孵育2 h，漂洗后加入1∶100稀释的RBITC标记的山羊抗兔IgG孵育1 h，激光共聚焦显微镜观察EGFP-LC3的点状聚集。

1.2.6平板计数法计算胞内SA数量 分别转染siRNA UVRAG和pCI-neo-HA-hUVRAG，24 h后分别用SA感染1、2、3、4、5 h，用含有0.5%的TritonX-100裂解细胞，将裂解液进行梯度倍比稀释，涂于胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行活菌平板计数。

1.3统计学处理 运用SPSS17.0统计软件分析进行方差分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1SA感染HeLa细胞诱导发生自噬 SA感染HeLa细胞1、2、3、4、5 h LC3 Ⅱ 的表达量与0 h的表达量相比显著升高(P<0.05)，其中感染1 h和2 h的LC3 Ⅱ 的表达量达到最高，感染1 h和2 h的p62的表达量与0 h相比显著降低(P<0.01)，SA感染HeLa细胞3 h、4 h和5 h的LC3 Ⅱ 的表达量与1 h和2 h的表达量相比显著降低(P<0.05)，感染3 h、4 h和5 h 的p62的表达量与1 h和2 h的表达量相比显著升高(P<0.05)。感染1、2、3、4、5 h的UVRAG表达量与0 h相比显著升高(P<0.05)(图1)。

2.2干扰或过表达UVRAG调控SA诱导的自噬 与对照组相比，感染1、2、3、4、5 h干扰UVRAG组LC3Ⅱ的表达量显著降低(P<0.05)，p62的表达量显著升高(P<0.05)(图2)。

感染1、2、3、4、5 h过表达UVRAG组与对照组相比，LC3Ⅱ的表达量显著升高(P<0.05)，p62的表达量显著降低(P<0.05)(图3)。

将SA(MOI=100)感染过表达UVRAG的HeLa细胞3 h，免疫荧光后用激光共聚焦显微镜观察EGFP-LC3的点状聚集。结果显示，过表达UVRAG组与对照组相比，EGFP-LC3的点状聚集数量显著升高(P<0.05)(图4)。

图1 SA感染HeLa细胞诱导自噬相关蛋白表达Fig.1 Autophagy was induced in HeLa cells infected with SANote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs 0 h，#.P<0.01 vs 0 h，△.P<0.05 vs 1 h and 2 h，▲.P<0.05 vs 1 h and 2 h.

图2 抑制UVRAG降低SA感染HeLa细胞诱导的自噬水平Fig.2 Autophagy was suppressed in SA infected HeLa cells by siRNA knockdown of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B and p62.*.P<0.05 vs NC.

图3 过表达UVRAG升高SA感染HeLa细胞诱导的自噬水平Fig.3 Autophagy was elevated in SA infected HeLa cells by over-expression of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs HA-UV.

2.3UVRAG调控胞内SA的复制 将SA(MOI=100)分别感染干扰及过表达UVRAG的HeLa细胞1、2、3、4、5 h，平板计数法计算胞内菌数量。结果显示，干扰UVRAG使胞内菌数量显著上升(P<0.05)，过表达UVRAG使胞内菌数量显著下降(P<0.05)(图5)。

3 讨论

SA与自噬的相互作用具有其独特的方式，SA通过降低细胞内cAMP的方式促进自噬[12]。SA产生的α-溶血素参与自噬通路的激活，并且阻止自噬体的成熟[13]。α-溶血素还可以诱导宿主细胞产生来自于吞噬体的丝管状结构，而这些丝管似乎是SA胞内复制所必需的[14]。体内研究显示自噬相关基因Atg16L1缺陷介导的对SA感染引起的脓毒症和肺炎的易感性依赖于α-溶血素[15]。本研究用SA感染HeLa细胞1 h和2 h的LC3Ⅱ的表达量升高，感染3 h、4 h和5 h的表达量降低，SA感染细胞后LC3Ⅱ的表达量先升高后降低的趋势与SA感染RAW264.7细胞引起LC3Ⅱ表达量的变化趋势一致[16]。本研究SA感染HeLa细胞引起p62表达量的变化趋势与SA感染NIH/3T3细胞引起的p62的表达量的变化趋势一致[17]。此研究结果表明SA感染细胞后能够引起并调控宿主细胞的自噬水平。

研究发现UVRAG能够促进自噬体的形成与成熟[18]，之后有研究发现一些miRNAs可以靶向UVRAG，并且通过调控UVRAG的蛋白表达从而调控自噬[19]。本研究用SA感染HeLa细胞发现UVRAG的蛋白表达量升高，研究发现丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞也能够引起UVRAG的蛋白表达量升高[20]。过表达UVRAG后感染SA LC3Ⅱ的表达量比未过表达UVRAG对照组的LC3Ⅱ的表达量升高，研究发现过表达UVRAG后感染结核分枝杆菌比未过表达UVRAG对照组的LC3Ⅱ的表达量升高[21]。过表达UVRAG后感染SA EGFP-LC3的点状聚集比对照组的点状聚集多，研究发现用Jurkat细胞过表达UVRAG后用激光共聚焦显微镜观察点状聚集升高[22]。此研究结果表明UVRAG可以调控SA感染诱导的自噬水平。

那么UVRAG能否调控SA的胞内复制？本研究发现过表达UVRAG后感染SA可以使胞内SA数量降低，而干扰UVRAG后感染SA可以使胞内SA数量升高。研究发现敲低BMDMs细胞感染结核分枝杆菌的胞内菌数量也升高[21]，另外研究发现过表达UVRAG后感染丙型肝炎病毒可以降低病毒的复制[20]。宿主细胞中某些蛋白参与了自噬介导的胞内SA的清除。研究发现磷脂酶C相关催化活性蛋白(PRIP)参与的自噬能够清除SA感染非专职吞噬细胞[23]。SA感染非专职吞噬细胞后被WIPI-1阳性的自噬体样囊泡包裹，而且这些WIPI-1阳性的囊泡会被溶酶体降解[24]。那么，宿主细胞中还有哪些蛋白参与了自噬介导的胞内SA的清除需要进一步挖掘探索。