SMAC类似物Birinapant对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究①

高 宏 易竹君 李培志 朱稀雯 龚建平 陈 翔

(重庆市第四人民医院肝胆外科，重庆 400014)

第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂(second mitochondria derived activator of caspases,SMAC)是一种存在于线粒体内调节细胞凋亡的蛋白质，目前关于SMAC及SMAC类似物的研究主要集中在其促进肿瘤细胞凋亡的研究上[1-4]。Birinapant作为一种典型的SMAC类似物，能够通过与cIAP1结合诱导cIAP1的降解进而促进细胞的凋亡[5,6]。许多cIAPs抑制剂被设计为与SMAC类似物有相同的作用，用于癌症的治疗[7-9]。然而，关于SMAC类似物在炎症反应中的研究还很少。

肝脏缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)是实验以及临床肝移植术成功与否的重要因素。I/RI分为缺血期损伤和再灌注期损伤，就再灌注期损伤而言，内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的库普弗细胞(kupffer cells,KCs)过度激活是再灌注期I/RI的重要诱因之一。其机制与再灌注期LPS激活KCs丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路有关[10,11]。而巨噬细胞内LPS介导的MAPK信号通路的激活又与肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis receptor related factor 3,TRAF3)的聚泛素化有关[12,13]。TRAF3 K48连接的TRAF3聚泛素化导致髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)复合物的蛋白降解和胞质转位，通过促进p-JNK和p-p38的表达激活MAPKs信号通路，诱导炎症因子表达，如TNF-α、IL-1、IL-6以及IL-1β等[12,14]。

研究已经证实SMAC类似物Birinapant可通过抑制cIAP1的表达抑制TRAF3的降解以及抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内MAPK信号通路激活，进而减轻LPS介导的炎症反应[15]。那么，Birinapant预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用是否通过抑制KCs中TRAF3的降解来抑制再灌注期LPS介导的KCs MAPK信号通路激活，从而抑制炎症因子释放，进而抑制肝脏I/RI，目前尚无相关研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 TRAF3、cIAP1、p38、p-p38、JNK、p-JNK以及β-actin的主要抗体购自Abcam(Cambridge，MA,USA)。用于检测TNF-α、IL-6和IL-1β的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。Birinapant购自Selleckchem(Burlington,ON,Canada)。

1.1.2动物和分组 由重庆医科大学实验动物中心提供的SD雄性大鼠，年龄5周，重(150±17.4)g。所有实验动物都严格遵循国家动物研究和法律规定，均受到了人性化的护理。将大鼠分为空白对照组(Blank)、对照组(Control)和Birinapant预处理组(Birinapant)。Blank组不做任何处理，Control组腹腔注射30 mg/kg体重的生理盐水，1 h后构建大鼠肝脏I/RI模型，Birinapant组腹腔注射30 mg/kg体重的Birinapant，1 h后构建大鼠肝脏I/RI模型。各组在模型建立4 h后取下肝脏组织、采集血液样本、提取肝脏KCs，将KCs按4×105个/孔的细胞密度接种在6孔板中用完全培养基培养。

1.2方法

1.2.1组织病理学研究 肝组织固定在10%福尔马林中，切成5 μm厚的切片。将石蜡切片进行HE染色，具体方法详见参考文献[6]。

1.2.2免疫印迹 KCs中TRAF3和cIAP1、p-JNK、 p-p38等蛋白表达通过Western blot检测。即提取KCs细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，所得蛋白样品与上样缓冲液以4∶1混合后变性，取50 μg/孔蛋白样品上样，依次进行电泳、转膜，5%的BSA在37℃封闭1 h，分别加入不同抗体4℃过夜孵育，TBST洗3遍×15 min，加入对应的二抗(1∶5 000)37℃孵育1 h，TBST 洗3 遍×15 min，ECL化学发光显影。

1.2.3KCs免疫荧光实验 将KCs以1×104个/孔的密度接种在含有拨片的24孔板中培养24 h，通过固定、透膜、封闭，加入适量适宜浓度的cIAP1和TRAF3 抗体4℃过夜孵育，用PBS洗3次×1 min/次，加入相应的荧光二抗在室温下避光孵育1 h，用PBS 洗3 次×1 min/次，加入适量DAPI 处理3～5 min，固定、封片，正置显微镜观察、采图。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA检测小鼠血浆中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

2 结果

2.1Birinapant预处理抑制肝脏I/RI时肝组织的损伤和炎症反应 HE染色下观察Blank组、Control组和Birinapant组，如图1所示，与Blank组相比，Control组在肝脏I/RI建立后4 h肝小叶结构明显紊乱、大量肝细胞空泡样变性、有明显的肝细胞坏死和大量炎症细胞浸润等，即有明显的肝组织损伤和炎症反应。与Control相比，Birinapant组肝小叶结构基本正常，仅见少量肝细胞气球样变性和少量炎症细胞浸润。可见，Birinapant预处理可显著抑制肝脏I/RI时肝脏损伤和炎症反应。

2.2Birinapant预处理降低肝脏I/RI时血清TNF-α、IL-6及IL-1β的表达 检测各组血清中炎症相关因子TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。结果如图2所示，肝脏I/RI模型可以促进炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌，而预处理Birinapant可以显著抑制这些炎症因子的表达，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图1 大鼠肝脏组织HE染色Fig.1 HE staining of rat liver tissue

图2 大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β的表达水平Fig.2 Expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rat serumNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3Birinapant预处理对I/RI肝脏KCs中cIAP1/TRAF3/MAPK信号通路的影响 如图3所示：肝脏I/RI可明显促进KCs中cIAP1的表达，抑制TRAF3的表达，而预处理Birinapant可抑制cIAP1的表达，促进TRAF3的表达。

KCs的Western blot结果如图4所示：肝脏I/RI可以明显促进KCs中cIAP1的蛋白表达进而诱导TRAF3的降解，并通过促进p-JNK和p-p38的表达激活MAPK信号通路。预处理Birinapant可显著抑制KCs内cIAP1的表达进而抑制TRAF3的降解，并通过抑制p-JNK和p-p38的表达抑制MAPK信号通路的激活。Birinapant预处理对大鼠肝脏I/RI的保护作用可能与Birinapant抑制cIAP1/TRAF3/MAPK信号通路的激活相关。

3 讨论

研究表明肝脏I/RI主要与缺血期产生的LPS在再灌注期时通过过度活化肝脏KCs，激活KCs中MAPK炎症信号通路，诱导炎症因子表达有关[6,7]。而SMAC类似物Birinapant可通过抑制TRAF3的降解以及抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内MAPK信号通路激活，进而抑制LPS介导的炎症反应[10]。为了进一步探索以上假设，提取三组大鼠的KCs做以上实验。

图3 免疫荧光检测KCs中cIAP1和TRAF3的表达Fig.3 Immunofluorescence detected expression of cIAP1 and TRAF3 in KCs

图4 Western blot检测KCs中cIAP1和TRAF3以及与MAPK信号通路密切相关的JNK、p-JNK、p38及p-p38的蛋白表达Fig.4 Western blot detected protein expressions of cIAP1 and TRAF3 in KCs and JNK,p-JNK,p38 and p-p38 which closely related to MAPK signal pathwayNote: *.P<0.05,**.P<0.01.

肝脏I/RI是导致肝移植术后肝功能不良或进而导致肝移植失败的重要原因，目前仍无有效的治疗策略。就再灌注期损伤而言，研究已证实LPS诱导的单核/巨噬细胞过度激活是再灌注期I/RI的重要诱因之一[16,17]。由于机体80%～90%的单核/巨噬细胞为滞留于肝血窦内的KCs，因此，如何避免再灌注期KCs的过度激活已成为肝移植外科必须面对的挑战之一[18]。

SMAC是一种存在于线粒体内起调节细胞凋亡的蛋白质。目前发现SMAC可能具有促进肿瘤细胞凋亡的作用，如SMAC可促进胃癌、卵巢癌以及非霍奇金淋巴瘤等肿瘤细胞的凋亡[3,4,19]。其机制可能与在一些因素的刺激下，SMAC可从线粒体释放到细胞质与胞质中的cIAPs结合，抑制cIAPs抗凋亡活性，促进细胞凋亡，进而在一定程度上可抑制肿瘤的生长。随着近年来对SMAC蛋白结构和功能的深入了解，将SMAC类似物应用到各种肿瘤中的治疗成为了研究的新热点。Birinapant作为一种典型的SMAC类似物，能够通过cIAP1结合诱导cIAP1的降解进而促进细胞的凋亡[5]。许多cIAPs抑制剂被设计为与SMAC类似物有相同的作用，用于癌症的治疗[7]。然而，关于SMAC类似物在炎症反应中的研究还很少。

LPS是革兰氏阴性杆菌外膜的主要组成部分，能诱导巨噬细胞炎症因子分泌，其主要的分子机制与LPS激活单核/巨噬细胞MAPK信号通路，促进炎症因子释放有关[20]。而巨噬细胞内LPS介导的MAPK信号通路的激活又与TRAF3的聚泛素化有关[12]。研究表明TRAF3 K48连接的TRAF3聚泛素化导致MyD88复合物的蛋白降解和胞质转位，通过促进p-JNK和p-p38的表达激活MAPKs信号通路，诱导炎症基因表达[14]。而研究已经证实SMAC类似物Birinapant可通过抑制cIAP1的表达抑制TRAF3的降解以及抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内MAPK信号通路激活，进而减轻LPS介导的炎症反应[15]。然而，Birinapant预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用是否通过抑制KCs中TRAF3的降解来抑制再灌注期LPS诱导的KCs内MAPK信号通路激活，从而抑制炎症反应和炎症因子的释放，进而抑制肝脏I/RI，目前尚无相关研究。

在本研究中，预实验发现Birinapant预处理可以减轻肝脏I/RI，但具体机制仍不清楚。通过Birinapant预处理以及建立大鼠肝脏I/RI模型等，发现与Control组相比，Birinapant预处理可以显著抑制肝脏I/RI诱导的肝组织损伤和炎症反应、降低血清中TNF-α、IL-6及IL-1β炎症因子水平、抑制KCs中cIAP1的表达进而抑制TRAF3的降解以及可抑制KCs中p-JNK和p-p38的表达进而抑制MAPK信号通路的激活。本研究得出的结论是预处理Birinapant可以通过抑制cIAP1的表达抑制TRAF3的降解，进而通过抑制MAPK信号通路的激活，达到对肝脏I/RI的保护作用。

研究成果为进一步探讨肝移植I/RI的分子机制以及SMAC类似物在炎症方面的作用奠定了实验基础，具有一定的理论意义。研究也存在一定不足，如没有直接用肝移植模型进行研究，也未深入探讨其他可能存在的分子机制。