南岳茶油腐乳中乳酸菌的分离鉴定

李建周，肖尧婷，莫婷婷，罗佳茜，李汝芹，李悦桐，陈晓华※

(1.衡阳师范学院南岳学院，湖南 衡阳 421008；2.衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008；3.衡阳师范学院 南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008)

南岳茶油腐乳是一类利用毛霉、酵母和细菌共同作用改变豆腐中蛋白质风味的发酵豆制品，其发酵过程通常为天然发酵，腐乳中繁殖的乳酸菌从环境中偶然混入起作用。因此豆腐乳是分离和筛选优良乳酸菌的的丰富资源。从某种特定食品中分离筛选出的乳酸菌，可以制作成该食品进行乳酸发酵的发酵剂，而且是其发酵的最佳菌种选择，因为它们比从其它原材料中筛选出的乳酸菌具有更强的竞争力[1]。目前动物性乳酸菌比植物性乳酸菌应用更广泛，但实际上植物性乳酸菌在人体肠道中的存活率更高、生长能力更强，在耐盐和胆盐性质上优于动物性乳酸菌。对于中国人的体质，植物性乳酸菌不会造成机体的异体蛋白质排斥反应。从豆腐乳中分离筛选乳酸菌就能体现植物性乳酸菌的优势。

豆腐乳中乳酸菌的种类丰富，曹翠峰[2]在腐乳的微生物种类研究中表明豆腐乳的制作过程中不仅有生产用微生物毛霉，还检测出乳酸菌、肠道菌、真菌如酵母等微生物菌群。鲁绯[3]等在青方腐乳中筛选出了奇异菌属、片球菌属和乳杆菌属三个菌属的乳酸菌。南晓芳[4]等从市面上购买的不同厂家的腐乳中筛选出坚强肠球菌和粪肠球菌。邓加聪[5]从豆腐乳中筛选出10株乳杆菌属，其中有一株具有广谱抑菌活性。王夫杰[6]等从青方和白方腐乳中筛选出鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌四种乳酸菌。豆腐乳发酵前、后期都有种类丰富的乳酸菌的存在，腐乳的特殊发酵环境，赋予了乳酸菌不同于泡菜等传统乳酸菌来源开发的菌株的性质，国内对豆腐乳中乳酸菌的性质做了研究，筛选出许多性质优良、有开发潜力的菌株，也给我们提供了宝贵的参考价值。邓加聪[5]等从豆腐乳中筛选具有广谱抑菌活性乳酸菌，采用溶钙圈方法、产酸试验、形态学分析及生理特性判断是否为乳酸菌属；使用平板透明圈法对发酵上清液进行分析来研究抑菌活性，从而筛选出具有广谱抑菌活性的乳酸菌。鲁绯[3]在青方腐乳中筛选出一株短小奇异菌、一株植物乳杆菌、一株表观形态类似于片球菌的菌株，并且把这三株菌应用到豆腐乳的发酵生产中，发现片球菌对腐乳风味的协同作用最好，明显改善了腐乳的风味、改变了游离氨基酸的含量。王夫杰[6]从白方和青方腐乳中筛选出的四株乳杆菌均能耐受10%的盐度和5%的酒精度，其中有一株甚至能在10%的盐度和6%的酒精度下生长旺盛。鉴于此，本研究以南岳茶油腐乳为研究对象，从其筛选分离益生乳酸菌并利用16S rDNA技术对其进行生物学鉴定，为今后提高腐乳风味，改善腐乳品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原料：衡阳南岳豆腐乳。

MRS液体培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏10 g，柠檬酸铵2 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，葡萄糖20 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温80 1mL，蒸馏水1 L，培养基pH控制在6.2-6.4，灭菌锅设置参数121℃，20 min[7]。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入琼脂条2%[8]。

溶钙圈法培养基：在MRS固体培养基中加入碳酸钙2%[9]。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选实验流程

豆腐乳样品的取样→梯度稀释→平板涂布培养（溶钙圈法）→形状分析→革兰氏染色、过氧化氢酶鉴定→平板划线培养→甘油保藏。

1.2.2 乳酸菌的分离

根据Pringsulaka[10]等采用的溶钙圈法并做修改：取1 g腐乳块于9.0 mL无菌水中，通过玻璃珠震荡均匀，制成腐乳悬液，再进行梯度稀释，并依次采用浇注平板法置于含有碳酸钙的MRS培养基，37℃静止培养48 h。培养基中单菌落外围出现透明溶钙圈，且单菌落形状为圆形或椭圆形，颜色为白色或乳白色，标记此类菌落，初步确定为乳酸菌，进行进一步验证。

1.2.3 菌株生理性质研究

1.2.3.1 最适生长温度的测定

菌株培养至对数生长期，接取1%的菌悬液到MRS液体培养基中，分别置于15℃、20℃、30℃、37℃和42℃下静止培养24 h，用分光光度仪测定菌液在600 nm吸收波长处的OD值[11]。

1.2.3.2 最适生长PH值的测定

菌株培养至对数生长期，将菌悬液离心，转速为6 000 r/min，时间10 min。弃上清液，菌体用无菌生理盐水离心洗涤2-3次，并制成菌悬液。接取1%的菌悬液到特定pH值的MRS液体培养基中培养，pH分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0，培养温度为37℃，时间24 h，测定600 nm吸收波长处的OD值[12]。

1.2.3.3 最适接种量的测定

菌株培养至对数生长期，接取不同接种量的菌悬液至MRS液体培养基中培养，接种量分别为0.5、1、1.5、2、5、10%，培养温度为37℃，时间24 h，用分光光度仪测定菌液在600 nm吸收波长处的OD值[13]。

1.2.3.4 耐盐性的测定

菌株培养至对数生长期，接取1%的菌悬液至不同盐浓度的MRS液体培养基中培养，盐浓度分别为0、3、5、7、9、11、13%，培养温度为37℃，时间24 h，用分光光度仪测定菌液在600 nm吸收波长处的OD值[14]。

1.2.3.5 耐胆盐性的测定

菌株培养至对数生长期，接种1%的菌悬液至不同胆盐浓度的MRS培养基中培养，胆盐浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4和0.45%。胆盐类型为牛胆汁粉（胆盐三号），培养温度为37℃，时间24 h，用分光光度仪测定菌液在600 nm吸收波长处的OD值[15]。

1.2.3.6 产酸能力的测定

菌株培养至对数生长期，接取5%的菌悬液至MRS液体培养基中培养，培养温度为37℃，通过每隔6 h测定72 h内各菌株的pH值、总酸随发酵时间的变化，得到产酸能力强、发酵性能高的优良菌株。菌液中总酸（以乳酸计）测定：用0.1 mol/L的NaOH溶液进行测定，然后换算成乳酸度，以0T表示。采用NaOH滴定法测定[16]。

式中N指NaOH的浓度，V1指所用NaOH的体积，V2指滴定菌液体积。

1.2.3.7 生长曲线的测定

菌株培养至对数生长期后，接取2%的菌悬液至MRS液体培养基中培养，培养温度为37%，每培养2 h用分光光度仪测定菌液在600 nm吸收波长处的OD值，然后根据菌株OD值绘制生长曲线[17]。

1.2.4 菌株的鉴定

1.2.4.1 初步鉴定

按照凌代文[18]的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中介绍的方法，将所有革兰氏阳性，过氧化氢酶试验阴性的分离菌株初步鉴定为乳酸菌。

1.2.4.2 细菌16SrDNA生物学鉴定

采用细菌16S rDNA基因通用引物57F:5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和205R:5'-CTTGTTACGACTTCACCC-3'进行PCR扩增后送样检测。测序结果在NCBI上用Blast进行同源检索，利用MEGA X软件构建系统发育树。

1.2.5 数据分析

采用Excel 2019和Origin Pro 2019b进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 菌落形态与细胞形态观察

溶钙圈法可用来初步鉴定乳酸菌，从初步鉴定的38菌株中挑选透明圈直径与菌落直径比值较大的6株菌株进行菌落形态与细胞形态观察，结果见表1。

表1 菌株的形态特征

RSP1-RSP6菌株在MRS固体培养基上平板划线后生长旺盛，在37℃厌氧的环境下培养48h，形成白色菌落，形态分别如图1所示；6株菌均为球菌，长×宽为0.569~0.601μm×0.564~0.589μm，均不产生色素。

图1 RSP1-RSP6菌落形态

对6株菌进行革兰氏染色，用光学显微镜进行观察形态，结果如图2所示，它们均为革兰氏阳性菌，球状，成对或四联排列。过氧化氢酶鉴定结果为阴性，可以初步鉴定为片球菌属或者气球菌属[19]。

图2 RSP1-RSP6细胞形态（×1000）

2.2 菌株生理特性研究

2.2.1 菌株最适生长温度

不同培养温度对菌株的生长影响见图3，RSP1~RSP6 6株菌在温度为20~42℃范围内均可生长，在15℃左右不生长或生长能力差，而在37℃时进入生长高峰期，40℃之后生长明显受限。6株菌的最适生长温度均在30~37℃之间。研究表明乳酸菌最适生长温度为30~40℃，20℃以下一般不生长。

图3 不同温度对菌株生长的影响

尚天翠[20]对乳酸菌的生长情况受温度的影响做了研究，其最适生长温度为38℃，在30~42℃之间生长良好。由此可见RSP1~RSP6菌株所需的生长温度在正常值范围。

2.2.2 菌株最适生长p H值

不同pH值对6株乳酸菌生长的影响见图4。RSP4、RSP5和RSP6适合生长的pH值范围较广，在4.0~7.0范围内都能很好地生长，其最适生长pH值为6.0左右，pH值低于4.0时生长受到明显抑制。而RSP1、RSP2和RSP3的pH值生长范围为5.0~7.0，RSP2的最适生长pH为5.5，RSP1和RSP3株菌的最适生长pH值为6.5左右，pH值低于5.0时生长受到明显抑制，在pH值为4.0时几乎不生长。乳酸菌一般最适生长pH为5.5~6.0之间，耐酸性较强，比其他细菌更能在酸性环境下生长。从各类泡菜中筛选的乳酸菌最适pH值范围为3.0~7.0，而豆腐乳周围环境酸度比泡菜低，所筛乳酸菌耐受酸度的能力较弱，能在pH=4.0下生长的RSP5等菌株耐酸性比普遍豆腐乳中筛选的菌株强，但是比泡菜中筛选的乳酸菌弱。赵立彬[21]等从四川泡菜中筛选的耐酸性较好的LL-1、LL-4、ZZ-2能耐受pH=2.5的环境。而杨晓宇[22]从禽畜体内分离出来的乳酸菌的LS、LJ2能耐受pH=2.0的酸性环境。研究表明片球菌属在pH=5.0时能够生长，气球菌属的耐酸能力明显弱于片球菌，在pH=5.0的环境下不能生长[23]。由此本实验筛选的6株菌初步确定为片球菌。

图4 不同p H对菌株生长的影响

2.2.3 菌株最适接种量

图5 不同接种量对菌株生长的影响

不同接种量对6株菌生长的影响见图5，由图可见接种量对乳酸菌的生长情况影响不明显。而在接种量为0.5~10%的范围内，6株菌的生长随着接种量的增大反而降低，RSP4和RSP5最适接种量为1.7%左右，RSP1、RSP3和RSP6最适接种量在1.5%左右，RSP2最适接种量为1.0%左右。总的来说，6株菌的最适接种量在0.5~1.5%之间。乳酸菌筛选的活化、性质研究过程普遍所用接种量为1.0%，也有部分针对活性较弱的菌株，使用2.0%的接种量，则RSP1~RSP6的接种量对菌株的影响在正常范围。

2.2.4 菌株耐受NaCl的能力

豆腐乳中NaCl浓度较高，6株菌均在豆腐乳中分离得到表明它们均有较强的的耐盐能力。球菌的耐盐能力普遍大于杆菌。6株乳酸菌耐受NaCl的能力见表2，RSP1、RSP2和RSP3这3株菌明显比RSP4、RSP5和RSP6 3株菌的耐盐能力差。RSP1、RSP2和RSP3能够在NaCl质量分数为7%的培养基中正常生长，在NaCl质量分数为9%的环境下几乎不生长。而RSP4、RSP5和RSP6这3株菌能够在NaCl质量分数为11%的培养基中正常生长，在NaCl质量分数为13%的环境下几乎不生长。相对而言，RSP5的耐盐性最好，在NaCl浓度为7~9%的范围内生长旺盛。从泡菜等酸性发酵食品中筛选的乳酸菌普遍最高只能在NaCl浓度为8%的条件下生长，如胡书芳[24]等从自然发酵酸菜中筛选的乳酸菌19株中，耐盐性最好的菌株也只能在盐浓度为8%时生长，而其他多数菌株只能耐受4%的盐浓度。由此可见，RSP1-RSP6这6株菌的耐盐能力均高于泡菜等酸性食品中筛选的乳酸菌。南晓芳[4]等对豆豉和腐乳中的乳酸菌进行了耐盐能力的研究，筛选出三株耐盐能力达到12%的乳酸菌，其中1株为粪肠球菌，另外2株为坚强肠球菌。比较可知本研究筛选的乳酸菌比同源乳酸菌的耐盐能力弱。针对目前乳酸菌的分类，凌代文[18]在乳酸细菌分类鉴定和分析方法的研究中表示耐盐度在10%以上的乳酸菌主要分为片球菌和四联球菌这两个属。但是四联球菌的耐盐能力更强，其能耐受18%以上的盐度，这种性质与片球菌极为相似。

表2 菌株的NaCl耐受力

2.2.5 菌株耐受胆盐的能力

乳酸菌作为益生菌，要在人体内发生作用必须能够耐受胃酸和胆盐的损害，人体小肠的胆盐浓度一般在0.03~0.3%，可以在细胞外产生高渗透压，对菌体细胞造成影响。RSP1和RSP2这两株菌在胆盐浓度为0.20%时可以生长，但生长活力弱。RSP3-RSP6在胆盐浓度为0.20%时生长良好，胆盐浓度为0.35%时还可以生长，从表3可以看出，RSP6菌株耐受胆盐的能力最强。6株菌均能够在胆盐浓度为0.20%时生长，甚至可以超过0.35%，可见其在肠道的胆盐作用下也能正常生长繁殖，在小肠内起作用。赵立彬[21]对不同来源的乳酸菌进行耐胆盐分析，结果表示挑选的乳酸菌在人体小肠的胆盐浓度范围内均能生长，从四川泡菜、东北泡菜和其自制泡菜中筛选的10株菌株均能耐受胆盐浓度为0.3%的环境。

表3 表3菌株的胆盐耐受力（△OD600）

2.2.6 菌株的产酸能力

6株乳酸菌的产酸能力研究见图6。6株菌的产酸速度基本一致，RSP3的产酸速度最快，在16 h时pH值最低为4.3左右，而其他5株菌在20 h时才慢慢达到最低值。6株菌在26 h时进入稳定期且总保持较低值状态，均在4.0左右。谢静[25]等从腊鱼中筛选的乳酸菌的产酸能力强，其中乳酸片球菌在培养20 h时pH=3.5，戊糖片球菌在培养20 h时pH=3。可见本实验筛选的性质类似片球菌的6株菌的产酸能力在正常范围之内。

图6 6株乳酸菌发酵p H变化曲线

图7 6株乳酸菌发酵期间产酸情况

图7可知，RSP2、RSP3和RSP5这3株菌在16 h达到产酸峰值；RSP4和RSP6这2株菌在12 h时达到产酸峰值；RSP6在16 h时总酸达到2.1%左右，酸度最高。总体而言，RSP4和RSP6产酸速度最快，所有菌株产酸峰值均在1.50%以上，且在24 h后酸值稳定，均在1.30%以上。从泡菜中筛选的菌株产酸量在1.0~1.5左右，陈晓平[26]等从酸菜汁中分离出9株乳酸菌，产酸量最低为1.2%，最高为2.6%。对比可知，本研究6株菌的产酸能力均在平均水平以上，RSP6产酸水平最高。

2.2.7 菌株的生长曲线

6株乳酸菌在MRS液体培养基中的生长状态曲线见图8，6株菌均在培养4 h左右进入对数生长期，培养24 h左右进入稳定期。RSP1、RSP3两株菌的生长活性相对较弱，生长较慢。RSP2、RSP4和RSP5生长较快，活性较强，RSP6生长速度最快，生长周期与其他5株菌相比最短。

图8 6株菌的生长曲线图

2.3 菌株分子生物学鉴定

将RSP5和RSP6菌株进行16SrDNA测序，将所获得的序列与GenBank和Ezbiocloud数据库中已有细菌的16SrDNA序列进行相似性比较分析，最后选择同源性较高的序列，利用MEGA X软件构建系统发育树。由图9可知，RSP5、RSP6与戊糖片球菌亲缘最近，鉴定为戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）。

图9 系统进化树

3 结论

本研究通过溶钙圈法，从自然发酵的南岳豆腐乳中筛选出RSP1~RSP6 6株乳酸菌，初步鉴定为革兰氏阳性兼性厌氧球菌，并对这6株菌的生理性质进行了初步研究，结果表明RSP5和RSP6这两株菌在6株菌性质最为优良，可以在pH=4.0、盐度为11%、胆盐浓度为0.35%时存活，RSP5的耐酸、耐盐能力最强；RSP6的耐胆盐、产酸能力最强，生长活性最强、生长周期最短。将RSP5和RSP6菌株进行16S rDNA测序并构建系统发育树，发现RSP5、RSP6与戊糖片球菌亲缘最近，鉴定为戊糖片球菌。

致谢：

感谢湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（NYD201810）项目对本项目的支持。