阿司匹林对酸和胆盐诱导的Barrett食管患者食管鳞状细胞NF-κB活化和CDX2表达的影响

戴 结

中国人民解放军海军安庆医院消化内科，安徽 安庆 246003

在西方国家,2%～7%的成年人患有Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)，这是一种有恶性肿瘤风险的肠型化生黏膜取代胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)损伤的食管鳞状上皮黏膜[1]。高达40%的西方成年人存在GERD症状，目前尚不清楚为何这些人中只有少数发展为BE[2]。研究表明，当食管鳞状上皮细胞暴露于反流胃液中的有毒物质酸和胆盐时，个体之间在激活的分子通路上存在差异，这些差异可能决定了GERD 损伤的食管是通过鳞状细胞再生还是通过伴随 BE发展的化生而愈合[3-4]。

流行病学研究表明，使用阿司匹林和其他非甾体抗炎药(NSAIDs)可以预防由 Barrett 化生发展而来的食管腺癌[5]。最近的一项病例对照研究发现，阿司匹林可以防止Barrett化生在具有GERD症状的个体中发生，而其他NSAIDs则无这种作用[6]。与其他NSAIDs不同的是，阿司匹林除抑制从花生四烯酸中产生前列腺素的环氧合酶外，还抑制促炎性NF-κB通路[7]。因此，推测阿司匹林对Barrett化生发展的独特保护作用可能归因于其对NF-κB的抑制作用。

NF-κB在正常食管鳞状上皮中不激活，但在GERD炎症形成的食管上皮中被激活[8]。有研究发现，酸和胆盐在食管鳞状细胞中诱导NF-κB通路信号传导[9]。尾型同源盒转录因子2(CDX2)是一个受NF-κB信号传导影响的决定肠上皮细胞形成的关键转录因子[10]。CDX2启动子包含两个推测的NF-κB结合位点[11]。大量研究表明，酸和胆盐可以增加CDX2启动子的活性，并增加大鼠和部分人食管鳞状细胞中CDX2 mRNA 的表达[12-13]。在反流性食管炎的动物模型中，反流损伤的食管上皮在出现Barrett化生之前也表现出CDX2表达增加[14]。这表明发炎的食管鳞状上皮中CDX2的表达可能预示着BE的发展，而CDX2的表达可能是NF-κB通路信号传导的结果。

本研究主要探讨酸和胆盐在BE患者的食管鳞状细胞中诱导NF-κB活化和CDX2表达的机制，以及阿司匹林能否抑制这种表达。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂我们使用了2种非肿瘤性端粒酶永生化食管鳞状细胞(NES)系：NES-B细胞和NES-G细胞，分别由合并BE的GERD患者(NES-B)和无合并BE的GERD患者(NES-G)远端食管鳞状上皮内镜活检标本制成[15]，均购自美国ATCC细胞库。RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO等购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司；阿司匹林(含量98%)、盐酸、结合胆汁酸等购自上海抚生生物科技有限公司； CDX2、GAPDH、NF-κB/p50、p65、p-p65、IκB、p-IκB、PKAc等抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；两步法RT-PCR试剂盒、引物、Western blotting检测试剂盒、ECL发光液等购自南京凯基生物科技有限公司。

1.2 细胞培养所有细胞均生长于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，37 ℃、饱和湿度条件下常规传代培养。实验选用细胞均为对数期细胞。

1.3 酸和胆盐暴露将细胞暴露于3种不同的实验培养基：(1)酸性完全生长培养基(用1 mol/L HCl使pH值达到4.0)；(2)中性胆盐培养基(含有总浓度为400 μmol/L的结合胆汁酸，pH值为7.2)；(3)酸性胆盐培养基(同一胆汁酸溶液，pH值为4.0)。中性完全生长培养基(pH值为7.2)作为对照培养基。 在24 h的暴露中，将酸性完全生长培养基和酸性胆盐培养基的pH值调整为5.5。

1.4 阿司匹林干预在Western blotting实验中，用100 μmol/L的阿司匹林预处理细胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和胆盐培养基30 min，然后收集细胞裂解物。在RT-PCR实验中，用100 μmol/L的阿司匹林预处理细胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和胆盐培养基24 h， 然后收集总RNA。在细胞系实验中，加入含有阿司匹林的酸性和胆盐培养基60 min，然后去除并置换中性 pH 培养基6 h。然后测定细胞提取物的荧光素酶活性。对照组为中性完全生长培养基(pH值为7.2)，加或不加阿司匹林。

1.5 蛋白质免疫印迹法检测用胰酶消化收集细胞，裂解液裂解细胞提取总蛋白。水浴法蛋白变性后，加入蛋白上样缓冲液，采用质量浓度为100 g/L聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶进行电泳分离，电转印至PVDF膜，质量浓度为50 g/L牛血清白蛋白室温封闭1 h，一抗按1∶1 000稀释，4 ℃下孵育过夜，二抗在室温下孵育2 h，使用ECL显影液发光显影。

1.6 染色质免疫沉淀法检测取提取的组织蛋白样品500 μg，加入抗p65或p50抗体10 μl，4 ℃轻摇2 h，加入20 μl蛋白A-琼脂糖，4 ℃轻摇过夜。4 ℃ 1 000×g离心，弃上清。1 ml PBS悬浮沉淀，4 ℃ 1 000×g离心5 min，洗涤沉淀。重复3次。4 ℃ 1 000×g离心，弃上清，留沉淀。上样缓冲液加入沉淀，煮沸5 min，离心后上样，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白、转膜，含5%(W/V)卵清蛋白的 TTBS缓冲液封闭，室温轻摇1 h，加入抗CDX2抗体，用TBS 缓冲液稀释抗CDX2抗体(1∶500)，将膜和适量的抗体稀释液放入杂交袋，4 ℃轻摇过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，与膜室温孵育1 h，用ECL增强发光显影。

1.7 荧光素酶报告基因检测NF-κB/p65的转录活性每个转染样品准备质粒-Lipo 2000混合液。 将质粒-Lipo 2000混合液加入含有细胞和培养基的48孔板中摇匀，置于37 ℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h，移去培养液，更换新鲜培养基，培养到48 h测荧光素酶活性。取5 μl细胞裂解液与萤火虫荧光素酶缓冲液及底物5 μl(按Promega双荧光报告系统测量试剂盒说明)混匀测量荧光强度，然后加入海肾荧光素酶反应缓冲液及腔肠素底物5 μl，混匀再次测得海肾荧光素酶活性。将每个样品按照海肾荧光素酶活性进行均一化处理，比较萤火虫荧光素酶活性并绘制图表。

1.8 免疫荧光技术检测p65蛋白的核转位滴加以0.01 mol/L，pH值为7.4的PBS稀释的特异性p65荧光抗体标本，覆盖p65抗原标本片，玻片置于有盖搪瓷盒内37 ℃保温30 min。先用PBS冲洗2次，然后按顺序过PBS三缸浸泡，每缸5 min，不时振荡，取出玻片，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。将玻片平放在有盖搪瓷盒内37 ℃保温30 min，再重复上述操作1次，取出玻片，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。荧光显微镜高倍视野下观察。

1.9 qRT-PCR法检测CDX2 mRNA的表达采用TRIzol法提取总RNA，逆转录得到cDNA，采用qRT-PCR试剂盒进行扩增操作，以GAPDH为内参检测细胞中CDX2 mRNA的表达量。引物序列：CDX2 上游5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

2 结果

2.1 酸和胆盐暴露后NES-B细胞和NES-G细胞中NF-κB亚基p50和 p65的核移位比较与未经处理的对照组比较，NES-B细胞和NES-G细胞具有相似水平的细胞质和细胞核p65和p50蛋白。用酸、胆盐或两者联合处理NES-B细胞，可以消除p65和p50的胞浆水平，并导致细胞核中p50和p65的水平显著升高。与此相反，用酸和胆盐处理NES-G细胞，细胞质中p50和p65的水平降低而不消除，并导致细胞核中p50水平升高，而p65水平仅略微升高(见图1)。

注：A：单纯酸组; B：单纯胆盐组; A&B: 酸及胆盐组; C：对照组。

图1 酸、胆盐和酸性胆盐暴露后NES-B和NES-G细胞中胞质和胞核p65和p50蛋白的表达水平变化

Fig 1 Changes of cytoplasmic and nucleus p65 and p50 protein expression levels in NES-B and NES-G cells after exposureto acid, bile salts and acidic bile salts

在本研究中使用NES-G细胞进行染色质免疫沉淀实验，结果显示，未经处理的NES-G细胞中p50和p65与CDX2启动子DNA的结合程度最低，虽然酸和胆盐暴露引起NES-G细胞中p50的核转位，但核转位并不伴随p50与CDX2启动子的结合增加(见图2)。

2.2 酸和胆盐对NES-B细胞和NES-G细胞中p50/p65异二聚体形成及与IκB和PKAc结合的p65量的影响对p50进行免疫沉淀，然后对p65进行蛋白质印迹，以证实NF-κB蛋白在NES-G和NES-B细胞系中形成异二聚体。结果显示，未受刺激的两种细胞均表现出p50/p65异二聚体形成。暴露于酸、胆盐和酸性胆盐后，NES-G细胞中的异二聚体形成量增加不明显，而NES-B细胞中的异二聚体形成量轻微增加(见图3)。对p65进行免疫沉淀法测定，然后对IκB进行蛋白质印迹测定，以确定细胞质中与IκB结合的p65的量。结果显示，在NES-G细胞中，暴露于酸、胆盐和酸性胆盐仅导致与IκB结合的p65极小量降低。 同样的暴露使NES-B细胞中仍与IκB结合的p65量明显减少。通过对p65蛋白的免疫沉淀法分析，发现蛋白激酶A (PKAc) 确实是NES 细胞中IκB-NF-κB复合物的一个组成部分。在NES-G细胞中，暴露于酸和胆盐仅引起PKAc结合的p65的最小量变化。在NES-B细胞中，暴露于酸和胆盐的结合，实际上消除了PKAc与p65的结合(见图4)。

注：A：单纯酸组; B：单纯胆盐组; A&B：酸及胆盐组; C：对照组。

注：IP为免疫沉淀法; IB为免疫印迹法。A：单纯酸组; B：单纯胆盐组; A&B：酸及胆盐组; C：对照组。图3 酸、胆盐和酸性胆盐暴露后NES-G和NES-B细胞质中p50/p65异二聚体形成情况Fig 3 Formation of p50/p65 heterodimer in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic bile salts

2.3 酸和胆盐对NES-B细胞和NES-G细胞NF-κB/p65的转录活性的影响暴露于酸、胆盐和酸性胆盐后，NES-B细胞的 IκB(Ser32/36)和 p65(Ser276)磷酸化水平明显升高。在NES-G细胞中这些相同的暴露导致IκB的磷酸化只有较少的增加，而p65的磷酸化仅有极少的增加(见图5)。利用NF-κB荧光素酶报告基因构建体，发现酸性胆盐处理能显著提高NES-B细胞中NF-κB/p65的转录活性，但在NES-G细胞中无这种效应(见图6)。

注：IP为免疫沉淀法; IB为免疫印迹法。A：单纯酸组; B：单纯胆盐组; A&B：酸及胆盐组; C：对照组。图4 酸、胆盐和酸性胆盐暴露后NES-G和NES-B细胞质中与IκB和PKAc结合的p65蛋白水平的变化 Fig 4 Changes of p65 protein bound to IκB and PKAc in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic biles

注：A：单纯酸组；B：单纯胆盐组；A&B：酸及胆盐组；C：对照组。

图5 酸、胆盐和酸性胆盐暴露后NES-G和NES-B细胞中IκB(Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的变化

Fig 5 Changes of phosphorylation levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) of NES-G and NES-B cells after exposure toacid, bile salts and acidic bile salts

2.4 阿司匹林对酸和胆盐诱导的NES-B细胞 IκB 磷酸化、 p65核转位、 CDX2启动子活化及CDX2 mRNA表达的影响用酸性胆盐和阿司匹林(100 μmol/L)处理NES-B细胞，并检测IκB和p65的磷酸化水平及CDX2启动子活性和mRNA表达。结果发现,阿司匹林预处理消除了酸性胆盐诱导的IκB磷酸化增加，而不消除p65的磷酸化(见图7)，并阻断了p65核转位的增加(见图8)。 阿司匹林消除了NES-B细胞中酸性胆盐诱导的CDX2启动子活性的增加(见图9)和CDX2 mRNA表达的增加(见图10)。

注：A&B：酸及胆盐组; C：对照组；与C比较,*P<0.05。

图6 NES-G和NES-B细胞在酸性胆盐暴露后NF-κB/p65的转录活性

Fig 6 Transcriptional activity of NF-κB/p65 in NES-G andNES-B cells after acidic bile salts exposure

注：A&B：酸及胆盐组; C：对照组。

图7 阿司匹林对酸和胆盐诱导的NES-B细胞中IκB (Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的影响

Fig 7 Effect of Aspirin on the levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) phosphorylation in NES-B cells induced by acid and bilesalts

3 讨论

Huo等[16]发现，酸和胆盐在NES-B细胞和NES-G细胞中激活NADPH氧化酶系统以产生H2O2，后者通过一系列的磷酸化作用激活IκB-NF-κB-PKAc复合物。本研究中我们发现，在NES-B细胞中IκB和p65的磷酸化水平远高于暴露于相同浓度酸和胆盐的NES-G细胞中的水平。由于NES-G细胞中IκB-NF-κB-PKAc复合物的有限激活，NF-κB亚基p65在细胞质中仍与IκB结合，与亚基p50不同，p65不会转移到细胞核中，这一点很关键，因为即使只有p50与CDX2启动子相结合，但核p65蛋白水平的增加是CDX2启动子被酸和胆盐激活所必需的[16]。最后，我们证明了阿司匹林可以阻止IKKβ激活 IκB，阻断酸和胆盐诱导的NES-B细胞IκB的磷酸化、p65的核转位、CDX2启动子的激活和CDX2 mRNA的表达。

注：DAPI显示同一区域的细胞核数目(比例尺=50 μm)。A&B：酸及胆盐组; C：对照组。

图8 免疫荧光技术观察阿司匹林对酸和胆盐诱导的NES-B细胞中p65蛋白核转位的影响

Fig 8 The effect of Aspirin on acidic bile salts-induced nucle-ar translocation of p65 protein in NES-B cells observed by im-munofluorescence technology

注：A&B：酸及胆盐组; C：对照组;与C比较,*P<0.05。

Fig 9 Effect of Aspirin on activation of CDX2 promoter inNES-B cells induced by acidic bile salts

注：A&B：酸及胆盐组; C：对照组。

图10 阿司匹林对酸和胆盐诱导的NES-B细胞中CDX2 mRNA表达的影响

Fig 10 Effect of Aspirin on expression of CDX2 mRNA in NES-B cells induced by acidic bile salts

本研究已经阐明了合并与不合并BE的GERD患者食管细胞在酸和胆盐激活 IκB-NF-κB-PKAc复合物程度之间的主要差异。这些差异可以解释为什么酸和胆盐能诱导NES-B细胞而不诱导NES-G细胞中CDX2的表达。CDX2是肠型柱状上皮形成所需的关键同源异型基因，CDX2在食管鳞状细胞中的表达预示着肠化的发生。因此，GERD患者在反流引起食管IκB-NF-κB-PKAc复合物激活(NF-κB信号导致CDX2的表达)程度上的差异可能决定了其是否导致Barrett肠型化生的发展。

NF-κB活性可由多种信号触发，所有这些信号最终都会汇聚到一个共同的靶点—细胞质IκB-NF-κB-PKAc复合物上。复合物中IκB蛋白的磷酸化导致其降解，同时释放 PKAc和NF-κB亚基p65。触发IκB降解的信号也可激活PKAc，导致p65(Ser276)磷酸化，这是一种有利于p50/p65异二聚体形成和刺激p65转录活性的翻译后修饰。此外，在免疫沉淀实验中，PKAc的激活强度已被证明与p65结合的PKAc的丢失相关[17]。使用免疫沉淀法和蛋白质印迹法，我们发现，PKAc确实与IκB和p65共存于食管鳞状细胞的复合物中。我们还发现，酸和胆盐使NES-B细胞而非NES-G细胞中结合在IκB和PKAc上的p65明显减少，伴随着p50/p65异二聚体形成的轻微增加和NF-κB/p65转录活性的显著增加。

NSAIDs、Barrett化生和Barrett癌症之间的关系仍是一个极具争议的话题，不同的研究有时会得出相互矛盾的结论。例如，最近的一项使用Meta分析方法对病例对照研究的数据进行汇总的调查发现，NSAIDs(包括阿司匹林)的使用和BE的存在无相关性[18]。与其他NSAIDs不同，阿司匹林阻断ATP与IKK-β的结合，从而使其磷酸化IκB的主要功能丧失[19]。我们发现，浓度为100 μmol/L的阿司匹林消除了NES-B细胞中酸和胆盐诱导的IκB磷酸化、 CDX2启动子活化和 CDX2 mRNA 表达的增加。阿司匹林对 p65的磷酸化无影响，这是因为PKAc 的作用，PKAc是一种不被阿司匹林抑制的酶。服用阿司匹林治疗慢性炎症性疾病的患者血清浓度范围为1 000～5 000 μmol/L，故通过口服给药很容易达到100 μmol/L的血清浓度[7]。因此，本研究阐明了阿司匹林可以预防GERD患者发展为BE(在应对酸和胆汁的反流过程中其鳞状上皮表达CDX2)的分子机制。

最后，本研究结果可能对采用射频消融术(RFA)治疗的BE患者的管理有重要意义，RFA是目前消除发育异常的BE的首选内镜治疗方式[2]。RFA使用以导管为基础的球囊电极，向化生的黏膜提供射频能量，造成广泛的周围热损伤。然后，患者接受质子泵抑制剂(PPIs)治疗，以控制酸反流和使消融的化生柱状黏膜与新鳞状上皮愈合。早期研究表明，RFA后Barrett化生复发率较低，但最近的研究显示复发率高得多，在一些报道中，4年内复发率接近50%[20]。这些复发的原因尚不清楚，但很可能是由于GERD诱导的食管损伤引起的，因为PPIs治疗并不能完全阻止这种损伤。即使是高剂量的PPIs，也不会使许多BE患者的食管酸暴露正常化，尽管有PPIs治疗，但胆汁酸反流仍然存在[21]。如果复发性Barrett化生的发病机制涉及反流的酸和胆盐触发IκB-NF-κB-PKAc复合物和NF-κB信号的激活导致CDX2的表达，那么阿司匹林治疗可能会中断这一过程。因此，本研究结果为阿司匹林(联合PPIs)阻断食管上皮细胞中NF-κB的激活从而防止RFA后复发性Barrett化生的临床试验提供了分子理论基础。

总之，本研究证明了合并BE与不合并BE的GERD患者食管鳞状细胞在酸和胆盐激活NF-κB通路的强度方面存在显著差异，这可解释充分激活的NF-κB通路仅在BE患者的鳞状细胞中引起CDX2表达。此外，可以通过使用阿司匹林抑制IκB的磷酸化来阻断酸和胆盐诱导的CDX2表达。这些结果阐明了分子机制并可以解释为什么一些GERD患者会发展成BE而其他人却未发展成BE，以及为什么阿司匹林可以防止BE的发展。