薄荷复方煎液对龋病及牙周病常见致病菌生理活性的抑制作用

王舞妮 赵俊文 邓彩弟 翁子梅

[摘要]目的 探討分析薄荷复方煎液对龋病及牙周病常见致病菌生理活性的抑制作用。方法 于2018年6月选取华西口腔医学院卫生部提供的牙龈卟啉单胞菌、血链球菌作为本研究的实验菌株，选用薄荷、白芷、川椒、细辛、石菖蒲、补骨脂、仙灵脾等十多味中药制成的薄荷复方煎液作为实验药物，并将其稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16不同浓度的药物，分别作为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4，另外选择不加药液的培养液作为对照组。观察不同薄荷复方煎液对两种口腔细菌的产酸能力及合成水不溶性胞外多糖能力的抑制作用。结果 四个平行实验组和对照组的pH值均低于初始pH值，差异有统计学意义（P<0.05）。四个平行实验组的pH值均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且随着薄荷复方煎液浓度的不断降低，pH值逐渐降低，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。四个平行实验组中不溶性葡聚糖含量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;且随着薄荷复方煎液浓度的不断降低，牙龈卟啉单胞菌、血链球菌两种菌株合成的不溶性葡聚糖含量逐渐升高，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 薄荷复方煎液对龋病及牙周病常见致病菌如牙龈卟啉单胞菌、血链球菌的酸代谢和糖代谢均有较好的抑制作用，且随着药物浓度降低，两种菌株生理活性的抑制作用有所减弱。

[关键词]薄荷复方煎液;龋病;牙周病;牙龈卟啉单菌;血链球菌;产酸;产糖

[中图分类号] R781.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）7（b）-0109-04

[Abstract] Objective To investigate and analyze the inhibitory effect of Peppermint Compound Decoction on physiological activity of common pathogenic bacteria of dental caries and periodontal diseases. Methods In June 2018， Streptococcus sanguis and Porphyromonas gingivalis provided by Ministry of Health， West China Stomatology Medical College was selected as the experimental strain. Peppermint Compound Decoction made of Peppermint， Angelica dahurica， Sichuan pepper， Asarum， Acorus calamus， Psoralen， Xianling Spleen and so on was used as experimental medicine. And it was diluted to 1∶2， 1∶4， 1∶8， 1∶16 different concentrations of drugs as the experimental group 1， the experimental group 2， the experimental group 3， the experimental group 4. In addition， the culture medium without medication was selected as the control group. The inhibitory effect of Peppermint Compound Decoction on the acid production and the synthesis of water-insoluble extracellular polysaccharides of two kinds of oral bacteria were observed. Results The pH values of the four parallel experimental and control groups were significantly lower than those of the initial pH value （P<0.05）. The pH values of the four parallel experimental groups were significantly higher than those of the control group （P<0.05）， and the pH values gradually decreased with the decrease of the concentration of Peppermint Compound Decoction， there was significant difference between the four groups （P<0.05）. The content of insoluble dextran synthesized by Porphyromonas gingivalis and Streptococcus sanguis in the four parallel experimental groups were significantly lower than those in the control group （P<0.05）. The content of insoluble dextran increased with the decrease of the concentration of Peppermint Compound Decoction， and the difference between the four groups was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Peppermint Compound Decoction can inhibit the acid metabolism and glucose metabolism of common pathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis and Streptococcus sanguis. With the decrease of drug concentration， the inhibition of physiological activity of the two strains is weakened.

[Key words] Peppermint Compound Decoction; Caries; Periodontal disease; Porphyromonium gingivalis; Streptococcus sanguis; Acidogenesis; Sugar production

龋病、牙周病是临床口腔的常见病和多发病[1]。研究显示，在我国60%以上的人患有牙周病，尤其是65岁以上的老年人群，牙周病患病率更高达90%以上，恒牙的龋病患病率也在50%以上[2-3]。龋病、牙周病不仅与人们的日常生活密切相关，且已成为导致35岁以上人群牙齿缺失的主要原因之一，因此，如何有效抑制龋病、牙周病的口腔致病菌，改善口腔卫生状况成为临床关注的重点[4]。常规牙龈上下洁刮术和西医药物治疗的效果并不理想，近年来中医药在龋病、牙周病的防治中均得到了一定的应用[5]。牙龈卟啉单胞菌、血链球菌是龋病、牙周病等口腔疾病的常见可疑致病菌[6]。既往研究显示，薄荷、白芷、川椒、细辛、石菖蒲、补骨脂、仙灵脾等10味中药制成的薄荷复方煎液对牙龈卟啉单胞菌、血链球菌等龋病、牙周病致病菌均有一定的杀菌作用[7]。本研究通过分析薄荷复方煎液对常见致病菌生理活性的抑制作用，进一步探讨薄荷复方煎液的抑菌机制，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

于2018年6月选取牙龈卟啉单胞菌、血链球菌作为本次研究的实验菌株，选用薄荷、白芷、川椒、细辛、石菖蒲、补骨脂、仙灵脾等十多味中药制成的薄荷复方煎液作为实验药物，将制备好的薄荷复方煎液采用加倍稀释法稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16浓度的药物，分别作为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4四个平行实验组，另外选取不加入薄荷复方煎液的培养液作为对照组。

1.2仪器和器材

选用法国生物梅里埃公司的VITEK-32AMS型全自动细菌鉴定和药敏分析仪、法国生物梅里埃公司的mini-VITA1型全自动血培养仪、美国Shellab全自动厌氧培养箱、Orion 710A型pH计、CO2培养箱以及超净工作台。龋病致病菌选取华西口腔医学院卫生部提供的血链球菌（美国ATCC1000556），牙周病致病菌选取牙龈卟啉单胞菌（ATCC33277）。

1.3实验药物的制备

薄荷复方煎液组方选用薄荷15 g、白芷10 g、川椒10 g、细辛10 g、石菖蒲10 g、补骨脂15 g、仙灵脾10 g、蚤休15 g、露蜂房10 g以及食盐（炒）10 g共10味中药，药材洗净后加入1000 ml水中进行文火煎煮直至100 ml左右。然后将药液进行过滤离心3次，去除残渣，浓缩至1 g/ml作为薄荷复方煎液原液，消毒后将其稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16不同浓度的药物备用。

1.4培养基的配制

①TPY液体培养基的制备：精密称取TPY培养基13.2 g加入500 ml的蒸馏水搅拌均匀，然后加热煮沸至其完全溶解，分装后进行高压灭菌15 min。②脑心浸出液肉汤（BHI）的制备：精密称取18 g BHI加入500 ml的蒸馏水搅拌均匀，然后加热煮沸至其完全溶解，分装后同样进行高压灭菌15 min。

1.5致病菌的复苏

将1 ml TPY培养基加至血链球菌冻干粉EP管中，充分混匀后经37℃进行孵育保存至血链球菌复苏，经生化鉴定后将菌悬液平均分存至8个菌种保存管于-20℃中。使用接种环将菌悬液接种于血平板上并进行分区划线。

将1 ml小牛血清加至牙龈卟啉单胞菌冻干粉EP管中，充分混匀后将菌悬液转移至BHI培养基中，在80% N2、20% CO2、37℃条件下进行培养24 h，至牙龈卟啉单胞菌复苏。经生化鉴定后，传代选取符合典型形态特性的代菌种作为工作菌，菌悬液平均分存至8个菌种保存管于-20℃中。使用接种环将菌悬液接种于血平板上并进行分区划线。

1.6分组测定

使用1 mol/L的NaOH将BHI培养基调至初始pH值为7.4。取5支消毒试管，实验组1、2、3、4四个平行实验组的试管中首先按10∶1的体積比加入BHI培养基和血链球菌菌悬液，然后分别加入1∶2、1∶4、1∶8、1∶16四种不同浓度的薄荷复方煎液。另外，对照组的消毒试管中则按10∶1的体积比加入BHI培养基和血链球菌菌悬液，不加入薄荷复方煎液。各组均在80% N2、20% CO2、37℃条件下进行厌氧培养48 h，然后采用pH计测定各组培养物上清液的pH值。然后将各组培养液在6000 r/min的条件下离心20 min，留取沉淀物5 ml，经蒸馏水进行洗涤离心2次，再加入5 ml的0.4 mol/L的NaOH再进行洗涤离心3次，最后取上清液以蒽酮法测定各组水不溶性葡聚糖（water insoluble glucans，WIG）的含量。以同样操作方法测定不同浓度薄荷复方煎液对牙龈卟啉单胞菌的产酸水平和产糖水平的影响。

1.7统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分，计数资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度薄荷复方煎液对血链球菌和牙龈卟啉单胞菌产酸能力的影响

四个平行实验组和对照组的pH值均低于初始pH值，差异有统计学意义（P<0.05）。四个平行实验组的pH值水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;且随着薄荷复方煎液浓度的不断降低，pH值水平呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

与对照组比较，#P<0.05;与同组初始pH值比较，*P<0.05

2.2不同浓度薄荷复方煎液对血链球菌和牙龈卟啉单胞菌产糖水平的影响

四个平行实验组中牙龈卟啉单胞菌、血链球菌两种菌株合成的水不溶性葡聚糖WIG浓度均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;且随着薄荷复方煎液浓度的不断降低，不溶性葡聚糖含量呈逐渐升高趋势，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

口腔属于多菌系的环境，口腔内的菌群趋于微生态平衡的稳定环境保证了口腔的健康状态。一旦这种微生态的动态平衡被可疑病菌打破，即可能发生内源性感染，导致龋病、牙周病等[8]。近年来的研究显示，牙周病与龋齿等慢性口腔疾病的危害已不局限于影响口腔健康，还与脓血症和菌血症等全身系统性疾病的发生密切相关[9-10]，因此，有效防治龋病、牙周病对于改善口腔卫生状况，保证患者健康具有重要作用。龋病、牙周病均是由于口腔细菌慢性感染导致的感染性疾病，龋病的主要致病菌包括血链球菌、变形链球菌及粘性放线菌，牙周病的常见致病菌包括牙龈卟啉单胞菌和伴放线杆菌[11]。本研究选择血链球菌和牙龈卟啉单胞菌作为实验菌株。

产酸和产细胞外多糖是口腔致龋和致牙周病致病菌的重要生物学特征[12]。致病菌的致龋性与其产酸能力直接相关，其无氧酵解代谢过程中产生的有机酸会使局部pH值不断升高，当pH值达到5.5的临界范围后，会使牙体硬组织脱矿形成龋齿。致病菌合成细胞外糖的能力与也其致龋性密切相关，WIG能促进细菌的黏附和集聚，促进菌斑生物膜的形成，而菌斑生物膜也是牙周病发病的重要始动因子[13]。近年来，天然的中医药在龋病方面的治疗作用逐渐被临床重视。既往研究显示，薄荷、白芷、川椒、细辛、石菖蒲、补骨脂、仙灵脾等10味中药制成的薄荷复方煎液对于牙龈卟啉单胞菌、血链球菌等致病菌均有较好的抑制作用[14]。

本研究通过探讨薄荷复方煎液对于牙龈卟啉单胞菌、血链球菌生物活性的影响，分析其抑菌机制，结果显示，经不同浓度薄荷复方煎液作用后的四个平行实验组的pH值水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;两种菌株经不同浓度薄荷复方煎液作用后的四个平行实验组的合成不溶性葡聚糖含量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;牙龈卟啉单胞菌、血链球菌均有较强的产酸和产糖能力，薄荷复方煎液对其产酸能力和产糖能力具有良好的抑制作用，且这种抑制作用随着薄荷复方煎液浓度的不断降低而逐渐减弱，但在浓度1∶16时仍能发挥一定的抑制作用，提示薄荷复方煎液的抑菌作用可能与其能抑制致病菌的产酸能力和产糖能力等生物活性有关，这与国内之前一些学者[15]的研究一致。不过本次研究选择实验菌株种类较少，且其药物抑制致病菌生物活性的具体作用机制还需要进一步探讨[16]。

综上所述，薄荷复方煎液对龋病及牙周病常见致病菌如牙龈卟啉单胞菌、血链球菌的酸代谢和糖代谢均有较好的抑制作用，且随着药物浓度降低，两种菌株生理活性的抑制作用有所减弱。

[参考文献]

[1]孙静华，李仪红，侯本祥.龋病和牙周病主要致病菌分布的影响因素[J].北京口腔医学，2017，25（3）：156-165.

[2]江娅玲，冯明业，程磊.纳米载药系统防治龋病和牙周病的研究进展[J].华西口腔医学杂志，2017，35（1）：104-107.

[3]周璐，王可，许秀珍，等.4种利尿通淋药材水煎液对尿路感染不同致病菌的抑菌作用实验[J].抗感染药学，2017， 17（9）：261-263.

[4]李唐萍，边可胤，张向宇.柠檬精油对牙周致病菌抑制作用及其安全性初步研究[J].口腔医学研究，2017，33（1）：99-101.

[5]孙墅，丘创华，王舞妮.薄荷复方煎液对龋病及牙周病致病菌生理活性的影响[J].临床口腔医学杂志，2015，31（5）：273-275.

[6]朱健铭，翁幸鐾，吴晋兰，等.基于RNA-seq 技术的黄连水煎液对多耐药尿道致病性大肠埃希菌的转录组学研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2015，35（10）：776-782.

[7]孙墅，丘创华，王舞妮.薄荷复方煎液对龋病、牙周病致病菌杀菌作用的研究[J].临床口腔医学杂志，2015，31（6）：374-376.

[8]周家程，季一洲，孙炘宸，等.桃樹根水煎液对大鼠实验性牙周炎的治疗作用[J].中国民族民间医药，2016，25（16）：20-22.

[9]张舒慧，林玉坤，李海云，等.马钱子水煎液对肺癌细胞体内外的抑制作用[J].河南大学学报（医学版），2017，19（4）：194-196.

[10]卓诗勤，张浩，丁弋娜，等.硫熏和鲜切浙贝母的化学成分及其药理作用的比较研究[J].中华中医药学刊，2016（3）：618-621.

[11]李丽，刘文彦，王青.侧柏叶水煎液对糖尿病模型小鼠的治疗作用及作用机制探讨[J].济宁医学院学报，2017，40（4）：271-274.

[12]郭兴怀，张晓萍.慢性牙周炎主要牙周致病菌和口臭的相关性分析[J].临床口腔医学杂志，2016，32（5）：38-40.

[13]陈健明，谢跃伶，黄启媚.复方五倍子漱口液与氟化泡沫在防治龋病中的疗效对比与成本分析[J].海峡药学，2017 （3）：267-269.

[14]胡芳，王蕾，周佳，等.一种pH响应性纳米粒对牙周菌斑生物膜的抑制作用及生物相容性评价[J].齐鲁医学杂志，2018，19（1）：211-213.

[15]王舞妮，孙墅，戴轶，等.研究薄荷复方煎液对龋病、牙周病致病菌的抑制和杀灭作用[J].北方药学，2016，13（11）：21-22.

[16]丘创华，李卓成，孙墅.薄荷复方煎液对致龋菌生长代谢的体外研究[J].国际检验医学杂志，2016，25（2）：155-156.

（收稿日期：2019-01-08  本文编辑：祁海文）