Lnc RNA-PVT1对脓毒症急性肺损伤巨噬细胞凋亡的影响*

詹方勇 杨 帅 张振林

1.珠海市人民医院急诊医学部，广东 珠海 519000；2.珠海市人民医院EICU，广东 珠海 519000；3.珠海市人民医院检验科，广东 珠海 519000；

急性肺损伤( ALI)是指在感染、烧伤、创伤及放化疗等多种致病因素(非心源性)作用下造成的进行性呼吸功能降低与弥漫性肺间质，甚至可造成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[1]。ALI的主要特征为肺泡上皮细胞及肺间质、肺泡弥漫性水肿与微血管内皮细胞损伤，而导致的急性低氧性呼吸功能不全，属于脓毒症等严重疾病常见的迟发型并发症。ALI发病率为6. 8%左右，病死率高达40%～50%，严重威胁患者生命安全[2]。而诱发多器官功能障碍综合征(MODs)与脓毒性休克的重要因素为脓毒症(sepsis)，其中脓毒症最易受损伤的靶器官为肺脏，最早出现的是ALI与ARDS，且具有最高发病率，与脓毒症相关的ARDS 60天致死率高达38.2%[3]。本研究就此以分析Lnc RNA-PVT1对脓毒症急性肺损伤巨噬细胞凋亡的影响，如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 在上海生科院细胞资源中心取得THP-1单核细胞并进行培养及诱导，使其分化成巨噬细胞，并将THP-1源巨噬细胞分为空白组(TPH-1源巨噬细胞组)、模型组(脓毒症急性肺损伤巨噬细胞模型)及PVT1-siRNA 组。空白组给予正常培养液以培养24 h；模型组给以含1 μg·ml-1LPS 培养液易培养24 h；PVT1-siRNA 组在1 μg·ml-1LPS 刺激24 h基础上，采用Lip-fectamine TM2000 转染试剂盒转染siPVT1，在48 h后搜集细胞，并提取总RNA。

1.2方法 ①细胞培养与转染及分组实验：使THP-1单核细胞悬浮生长于RPMI-1640培养基(含10% FBS)中，放在培养箱(37 ℃， 5% CO2)中进行培养。生长期细胞取对数，细胞浓度调整为1×106cell·ml-1，在96 孔板进行接种，每孔100 μl加入PMA 10 ng，以使THP-1细胞得到诱导从而分化成巨噬细胞( 37 ℃，5% CO2) 。在24 h后，把培养液弃去，漂洗3次RPMI-1640 培养基(以37 ℃温浴进行漂洗)，并清除未贴壁的THP-1 细胞，继续培养24h(放在无血清RPMI-1640 培养基中)。本此实验使THP-1源巨噬细胞分为空白组、模型组和PVT1-siRNA 组。空白组予以正常培养液培养24 h；模型组予以含1 μg·ml -1 LPS 的培养液培养24 h；PVT1-siRNA 组在1 μg·ml-1LPS 刺激24 h的基础上，运用Lip-fectamine TM2000 转染试剂盒转染siPVT1，并于48 h后搜集细胞，提取总RNA。②qRT-PCR：提取细胞总RNA(采取RNAiso Plus试剂)。按照逆转录试剂盒说明书使提取的总RNA逆转录成cDNA。并根据SYBR Premix TaqⅡ试剂盒进行配置 20 μl 反应体系：SYBRII 10 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl、cDNA 2 μl及无酶水7.6μl。在LightCy-clerTM 480 Ⅱ qPCR(Roche，USA)仪对实时荧光定量PCR进行扩增。反应条件为：95℃预变性30 s之后 95℃ 为5 s，60℃为30 s，以40个循环进行复性；最后94℃为 90 s，60℃ 为180 s 并延伸，进行扩增曲线绘制。以GAPDH当做内参基因，由 2-△△Ct 计算相对定量。本次试验共计进行4次，结果取平均值对比。

1.3观察项目 ①对比各组在LPS诱导下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表达情况。②分析IL-1βmRNA、TNF-αmRNA与Lnc RNA-PVT1的表达关系。

2 结 果

2.1对比三组在LPS诱导下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表达情况 PVT1-siRNA组的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表达水平最高，其次是模型组，且三组之间均存在差异，P<0.05。见表1。

表1 各组在LPS诱导下的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表达情况比较

注：*表示与空白组对比P<0.05，#表示与模型组对比P<0.05。

2.2分析IL-1βmRNA、TNF-αmRNA与Lnc RNA-PVT1的表达关系 IL-1βmRNA与TNF-αmRNA均于RNA-PVT1呈正相关，P<0.05。见表2。

表2 IL-1βmRNA、TNF-αmRNA与Lnc RNA-PVT1的表达关系分析(n=4)

3 讨 论

ALI大多由脓毒症与败血症等多种因素引发，是炎症自我氧化与放大而造成机体损伤的一个结果[4]。而由脓毒症所导致的ALI，其发病机制最主要的是机体全身发生瀑布式炎症反应。在脓毒症出现时，由于机体会产生大量氧化脂质代谢物与炎症介质，导致白细胞与中性粒细胞等炎症细胞向肺组织浸润聚集，从而产生大量的炎性因子、氧自由基及趋化因子，最终造成肺组织损伤[5]。

有研究称[6]，在ALI中lncRNA具有重要作用，其与炎症反应存在紧密关联。这是由于LncRNA属于长度大于200 nt的非编码RNA类型之一，且多种疾病均与lncRNA的异常表达相关，如炎症、肿瘤及心血管疾病等，且lncRNA作为调节因子可通过多种途径参与细胞分化、增殖、凋亡、上皮间质转化及药物抵抗等[7]。本研究发现：PVT1-siRNA组的IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及Lnc RNA-PVT1表达水平最高，其次是模型组，且三组之间均存在差异，P<0.05。提示Lnc RNA-PVT1具有调控DNA水平、转录水平、转录后水平及染色体水平作用，且可通过调节蛋白质的互相作用与RNA及DNA碱基配对以进行调控机体免疫应答，从而影响炎症介质分泌及免疫细胞的分化与迁移，另外lncRNA PVT1还可通过结合TNF-α 与抑制JNK/NF-kβ信号通路以促进炎症反应[8]。本研究亦显示IL-1βmRNA与TNF-αmRNA均于RNA-PVT1呈正相关，P<0.05，提示lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中可能具有至关重要的作用。

综上所述，Lnc RNA-PVT1对脓毒症急性肺损伤巨噬细胞的凋亡具有重要影响作用。