系统性红斑狼疮血清外泌体miR-146a的表达及临床意义*

李文根 刘苏东 陈咏瑜 张 科 何雪春

1.梅州市人民医院/中山大学附属梅州医院 风湿免疫科，广东 梅州 514031；2.梅州市人民医院/中山大学附属梅州医院，医学检验实验中心，广东 梅州 514031

系统性红斑狼疮是一种以血清中出现多种自身抗体、多系统受累为临床特征的慢性自身免疫性疾病，目前发病机制尚未完全明确。目前研究已证实，微小RNA(miRNA)参与SLE的发生发展[1]。外周血miRNAs的表达失调与SLE患者的临床表现及脏器损害密切相关[2]。本研究通过检测SLE患者血清外泌体miR-146a的表达水平，探讨其在SLE的临床意义。

1 资料和方法

1.1临床资料

收集2018年1月至2018年8月38例初次确诊为SLE患者的外周血，其中女性35例，男性3例，平均年龄(31.87±8.88)岁；所有病例均符合1997年美国风湿病学会修定的SLE分类标准，根据有无肾脏损害分为狼疮性肾炎组(lupus nephritis,LN)和非LN组，其中狼疮性肾炎17例，非狼疮性肾炎21例，采用SLEDAI评分评估疾病活动度。对照组为同期健康体检者18例，其中女性16例，男性2例，平均年龄(29.44±5.48)岁。两组间性别、年龄差异均无统计学意义。

1.2实验方法

按ExoQuick试剂操作说明，在250μl血清中加入ExoQuick试剂63μl混匀，4℃静置30 min，1500×g 离心30min，管底可见沉淀物，100μl PBS重悬沉淀以备用。按Basic ExoRNA kit试剂说明书提取外泌体总RNA。700μl裂解缓冲液100μl加至外泌体重悬液后混匀，孵育5 min后加入140μl氯仿，震荡30 s，然后在冰上孵育1分钟后12000×g离心30 s，用15μl洗脱液洗脱柱上的总RNA。在提取前加入与人miRNAs无同源性的cel-miR-39外参照1μl (广州锐博公司合成)。按照广州锐博公司Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit逆转录试剂盒说明书进行操作，取5μl外泌体总RNA，以miR-146a的RT引物进行逆转录，获得miR-146a的cDNAs。逆转录的条件为37 ℃60 min，95 ℃5 min。然后以20μl反应体系进行荧光定量PCR，检测miR-146a的表达量。PCR反应条件为：95 ℃预变性15 min后，94℃15 s，55℃30 s，70 ℃30 s，40个循环。外参照cel-miR-39的检测按照试剂盒进行检测。每个样品做2复孔。采用SYBR实时荧光定量PCR仪进行检测，记录每个孔中荧光信号到达设定阈值时的循环数(Ct值)。根据待测标本的Ct值，以cel-miR-39作为外参，采用定量PCR中的相对定量法，用公式ΔCt来计算，其中ΔCt=Ct标本miRNA-Ctcel-miR-39，ΔΔCt=ΔCt患者miRNA-Ct正常对照miRNA，以N=2-ΔΔCt表示外泌体miR-146a的相对表达量。

1.3统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行分析，计数资料采用t检验或Fisher检验，两组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验；采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析miR-146a的表达水平，miR-146a的表达水平与临床参数的相关性采用Spearman相关分析，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析miR-146a表达水平在LN诊断中的敏感性和特异性，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

SLE患者血清外泌体miR-146a的表达水平明显低于健康对照组(P=0.0015)，差异有统计学意义；LN组miR-146a的表达水平略高于非LN组(P=0.067)，但差异无统计学意义，见图1。

A

B

在实验室指标方面，外泌体miR-146a表达水平与血沉及抗SSA抗体阳性率均呈负相关(分别为r=-0.370,P=0.022；r=-0.391,P=0.015)。miR-146a的表达水平与SLE患者的临床表现、补体C3及C4、SLEDAI评分均无相关性，见表1。

ROC曲线分析结果显示，miR-146a的表达水平对LN无临床诊断价值，其AUC=0.367(95%CI:0.150～0.500,p=0.067)，见图2。

图2 ROC曲线分析血清外泌体miR-146a的表达水平在LN诊断中的敏感性和特异性。

表1 Spearman’s相关分析SLE患者外泌体miR-146a表达水平与临床参数的相关性

注：*P<0.05为差异有统计学意义。

3 讨 论

miRNAs是一类非编码的小分子RNA，其表达异常与自身免疫性疾病密切相关。外泌体是一种细胞分泌的大小为30～100纳米的小膜囊，可从体液如血浆、血清、尿液等分离获得。外泌体富含miRNAs，可参与炎症反应和适应性免疫反应[3]。近年来研究发现，外周血中的miR-146a表达失调与SLE自身抗体的产生及脏器损害密切相关[1]。miR-146a可促进淋巴细胞亚群分化，增加B细胞反应性和自身抗体产生[4]。霉酚酸可使SLE患者T细胞的miR-146a表达上调[5]。这些研究结果提示miR-146a表达失调参与SLE的发生发展。

本研究结果显示，SLE患者血清外泌体miR-146的表达水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义；这与部分研究[6]结果相一致，但有研究发现外周血miR-146a表达上调[7]，Khoshmirsafa等[8]发现SLE患者外周血miR-146a表达水平与健康对照组的不存在差异。血清miR-146a表达水平与SLE疾病活动及尿蛋白存在负相关；LN患者的肾脏组织miR-146a 的表达显著下降[9]；活动性LN患者的尿外泌体miR-146a表达水平显著升高，而且可以鉴别LN是否处于活动，尿外泌体miR-146a可能是LN潜在的标志物[10]。本研究发现外泌体miR-146a表达水平与临床表现、尿蛋白及SLEDAI评分不存在相关性。ROC分析结果显示外泌体miR-146a表达对LN无鉴别诊断意义。Sun等人通过meta分析发现外周血中miRN-146a可能不是SLE潜在的生物标志物[6]。外周血miR-146a表达水平在SLE的意义有待深入研究。

综上所述，本研究通过检测SLE患者血清外泌体miR-146a的表达水平，发现外泌体miR-146a的表达失调，而且与SLE的部分临床特点密切相关，提示外泌体miR-146a可能参与SLE的发生发展。