温肾化痰方对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白胆固醇的影响

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病发生发展的基本病理基础，指在大中动脉内膜上积聚斑块的慢性炎症性疾病[1]，其斑块稳定性决定AS的进展及预后。有研究证明，AS易损斑块引起斑块破裂、血栓形成是引起急性心脑血管事件发生的主要因素[2]。易损斑块形成与脂质代谢障碍密切相关[3]。中医学认为易损斑块的发生机制与虚、痰、瘀、毒有关[4]。广东省名老中医罗陆一教授创立的温肾化痰方具有温肾化痰、活血化瘀功效，临床治疗心绞痛等心血管疾病效果显著[5]。本研究通过建立ApoE基因敲除小鼠AS模型，应用不同剂量温肾化痰方，观察小鼠血脂变化情况，初步探讨温肾化痰方干预AS易损斑块的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择SPF(specific pathogen free)级、体重为20～30 g、6周龄ApoE-/-雄性小鼠120只，由广州中医药大学动物实验中心提供。实验前普通饲料适应性喂养7 d。

1.2 药物与饲料 温肾化痰方(仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蒌皮15 g，乳香15 g)加工制成含生药0.526 5 g/mL中药浓缩液，由广州中医药大学附属第一医院中药房提供。高脂、高总胆固醇饲料含5%猪油及1%总胆固醇。阳性对照药为阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司生产，规格：每片20 mg)。

1.3 主要试剂与设备 测量脂质试剂盒：血浆总胆固醇(TC，南京建成A111-1)、三酰甘油(TG，Cloud-Clone Corp：CEB687Ge)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C，CUSABIO：CSB-EQ027860MO)。低速台式离心机，上海安亭飞鸽牌80-2B。

1.4 模型制备与分组 小鼠适应性饲养1周后，按体重分层随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组，各20只。空白对照组给予普通饲料喂养12周，余5组均予高脂、高总胆固醇饲料喂养8周后继而予以高脂饲料喂养4周。空白对照组及模型组均不给药，以生理盐水1 mL/d灌胃，阳性对照组予以阿托伐他汀5 mg/(kg·d)，低剂量中药组予以温肾化痰方5.256 g/(kg·d)，中剂量中药组予以温肾化痰方10.053 g/(kg·d)，高剂量中药组予以温肾化痰方20.106 g/(kg·d)，以上药液均在8周后开始灌胃，给药4周。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 体重测量 每周测量小鼠体重并记录，监测小鼠体重变化。

1.5.2 血脂检测 于第8周及第12周ApoE-/-小鼠经尾静脉采血后，常温下以3 000 r/min离心5 min，吸取上层血浆，按照相应检测试剂盒说明书检测血清TC、TG、LDL-C水平并记录。

2 结 果

2.1 各组小鼠体重比较 与空白对照组比较，第8周各组小鼠体重明显上升(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及各剂量中药组小鼠体重变化较一致，差异无统计学意义(P>0.05)。第12周，与空白对照组比较，余5组小鼠体重均上升(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及中、高剂量中药组小鼠体重降低(P<0.01)，低剂量中药组体重有下降趋势，差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性对照组比较，低剂量中药组体重下降幅度较小(P<0.05)，中剂量中药组及高剂量中药组体重下降幅度一致(P>0.05)。阳性对照组及各剂量中药组体重与空白对照组差异较大，说明他汀类药物及温肾化痰方无法使高脂饲料喂养的小鼠体重下降，但可在一定程度上控制小鼠体重上升，使体重上升幅度(体重连线斜率)接近正常小鼠。详见表1。

表1 各组小鼠体重比较(±s) 单位：g

与空白对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与阳性对照组比较，③P<0.01。

2.2 各组小鼠血脂指标水平比较 第8周，与空白对照组比较，其他各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均明显上升(P<0.01)；模型组、阳性对照组及各剂量中药组小鼠血脂水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第12周，与空白对照组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C水平明显上升(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及各剂量中药组小鼠血清TC、TG、LDL-C均明显下降(P<0.01)，其中阳性对照组及高剂量中药组血脂下降幅度明显，接近空白对照组血脂水平；各剂量中药组TC、TG、LDL-C水平均有不同程度下调，作用由小到大依次排列为：低剂量中药组<中剂量中药组<高剂量中药组；其中高剂量中药组血脂TC水平与阳性对照组基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)，TG及LDL-C水平稍高于阳性对照组(P<0.05)。详见表2、表3。

表2 各组第8周小鼠血脂指标水平比较(±s) 单位：μg/mL

与空白对照组比较，①P<0.01。

表3 各组第12周小鼠血脂指标水平(±s) 单位：μg/mL

与空白对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与阳性对照组比较，③P<0.05。

3 讨 论

AS是脂质等物质沉积导致动脉壁硬化、管腔变细、血管失去弹性的慢性退化性改变[6]，该变化可长期存在于人体体内而无任何不适。人体固有性免疫和获得性免疫被激活触发全身炎性反应，脂质侵蚀斑块纤维帽、血液突然转变剪应力等各种因素综合作用下，斑块稳定性降低，从而发生斑块破裂、血栓形成等病理变化，导致心肌梗死、脑梗死等严重心脑血管意外发生[7-9]。在众多因素中，脂质代谢障碍是AS形成、发展及恶化的关键因素之一。LDL-C等脂质通过被破坏的血管屏障沉积于内膜，经过一系列氧化应激反应诱导单核细胞分化为巨噬细胞，因吞噬凋亡形成泡沫细胞促进AS发展，并发生组织溶解，导致纤维帽破裂[10]；TC等物质通过新生血管进入斑块坏死核心，形成结晶并诱发炎症反应，促进脂质核心形成，侵蚀纤维帽，破坏斑块稳定性[8]。血浆LDL-C、TG和TC等脂质增加导致致敏性中性粒细胞及超氧化物增多，促进氧化应激及炎症反应，从而进一步促进AS易损斑块形成[11]。

有研究表明，降低血浆脂质水平可延缓甚至逆转AS斑块形成，防止斑块破裂及血栓形成，从而降低心脑血管意外发生率。阿托伐他汀是目前经循证医学证实有效的抗AS的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶选择性抑制剂，能降低血脂含量并稳定AS斑块[12]。故本课题以他汀类药物为阳性对照组，与中药降脂作用进行比较。

中医学多以症状命名，AS起病前无症状，斑块破裂后导致的病症涵盖中风、胸痹、厥心痛、真心痛等范畴。冠状动脉粥样硬化心脏病属于中医学“胸痹、心痛”等范畴。心痛之病，病位在心，其中与肾脏功能失调关系密切。心与肾关系在《黄帝内经》已阐述：“心之合脉也，其荣色也，其主肾也。”心肾相互交通，阴阳协调，人体才能阴平阳秘[13]。人体年老肾阳虚衰，水液气化失职，聚湿为痰，痰阻心胸；且衰微之肾阳无力温煦心阳，心气无力推动血液运行，血液瘀阻于心脉，故而引发本病[14]。治疗本病之法当以温肾为本，辅以化痰散瘀之法。本课题组所用温肾化痰方由广东省著名中医罗陆一教授结合自己的科研成果和二仙汤化裁而来。方中含有仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蒌皮、乳香五味药。仙茅温阳补肾、强骨通脉，淫羊藿补精益气、坚骨强心，二者同为君药，加石菖蒲开通心窍、宣气除痰，瓜蒌皮宽胸理气、开痰散结，佐以乳香通瘀活血，引诸药入心经，全方共奏温肾助阳，活血化瘀之效。

本研究结果显示：在高脂、高总胆固醇饲料喂养8周后，小鼠体重及血浆TG、TC、LDL-C水平较空白对照组明显上升；第12周，服用他汀类药物及中药小鼠体重上升幅度减慢，其中中药组随剂量增加小鼠体重上升幅度越慢，与阳性对照组相似，说明温肾化痰方具有一定程度的控制体重作用；各剂量中药组血清TC、TG、LDL-C水平较模型组明显下降，说明温肾化痰方下调血脂作用与阿托伐他汀相似。各剂量中药组均有不同程度的下调血脂能力，其中高剂量中药组血清TC水平与阳性对照组血脂基本一致，TG及LDL-C水平接近阳性对照组水平，说明高剂量温肾化痰方下调血脂能力与阿托伐他汀一致，且均接近正常小鼠血脂水平，其中以下调TC能力最强。

综上所述，温肾化痰方具有下调AS模型小鼠血脂作用，通过调节血脂代谢紊乱，从而稳定斑块，防治AS，减少心脑血管意外发生，其具体作用机制及实验研究有待进一步探讨。