血管紧张素原基因单核苷酸多态性与心房颤动的相关性及临床价值研究

向 丽,张维贞,黄 山,田 野

1.贵州医科大学检验学院,贵州贵阳 550002；2.贵州省人民医院临床检验中心,贵州贵阳 550002;3.贵州省人民医院心内科,贵州贵阳 550002

心房颤动(房颤)是一种心血管疾病,它受外部环境、基因型等多种因素共同影响。其具体发病机制尚不清楚[1],相关资料显示,房颤发生和发展的关键因素是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活导致心房重构[2-3]。在机体调节电解质和水平衡以及维持血压中，RAAS起着极其重要的作用，并且与机体心血管活动的生理过程密切相关。RAAS相关基因位点具有多态性,人体组织和血液中RAAS的活性及RAAS系统中相关的标志物水平与该系统的基因多态性相关。近年来,基因检测技术发展迅速,使得人类对群体或个体间RAAS基因位点多态性的研究得以实现，使得探讨基因多态性与疾病的相关性成为目前研究的热点。血管紧张素原(AGT)是由AGT基因编码的限速底物,在肾素以及血管紧张素原转化酶(ACE)的作用下形成血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ),Ang Ⅱ是促纤维化因子,可促进心房纤维化而最终导致房颤等各种心血管疾病。本研究通过对房颤患者AGT基因rs5046、rs2148582多态性位点进行分析,探讨这两个多态性位点与房颤的相关性，以期为临床对房颤的早期诊断及治疗提供理论依据,通过早发现、早治疗有效降低房颤的致残率和病死率。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2018年8月于贵州省人民医院就诊的房颤患者108例作为房颤组。纳入标准:患者由心电图检查、24 h动态心电图检查或心内电生理检查确诊。同时选取同期健康体检者100例纳入对照组。

1.2仪器与试剂 主要仪器:低温高速离心机、UV-759型紫外分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)、DJ-600型水浴箱(上海实验设备有限公司)、超低温冰箱(-80 ℃)、微波炉(中国青岛海尔公司)、高精度加样器及配套枪头(德国Eppendorf公司)、ABI 2400型PCR仪、DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、各种规格EP管、PCR管(200 μL，1 000支/包)、96孔PCR管盒、试管、枪头及各种一次性耗材。

主要试剂:血液基因组DNA快速抽提试剂盒(Buffer TBP、Buffer Digestion、Buffer PR、Protinase K、TE Buffer，10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0，中国上海生工生物工程股份有限公司)、Taq PCR Master Mix(2×blue dye、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂、蓝色示踪染料，均购自中国上海生工生物工程股份有限公司)、Low MW DNA Marker-A、4S Green Nucleic Acid Stain核酸染色剂、琼脂糖H、5×TBE电泳缓冲液(中国上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3方法 分别对房颤组和对照组患者采集静脉全血,分装于2支EDTA-K2的抗凝管中,每管约2 mL,自然沉淀后离心10 min后将血细胞平均分装于2支1.5 mL EP管中,置于-20 ℃冰箱保存。对所收集的血细胞进行基因组提取,其操作严格按照说明书进行,并检测所提取DNA的水平及纯度。DNA水平采用紫外分光光度仪进行检测；DNA纯度采用A260与A280的比值进行评估,标本纯度为1.8～<2.0即可用于后续试验。在DNA序列数据库Genebank上找到AGT rs5046、rs2148582位点的基因序列,运用 Primer Premier5软件设计这两个位点的上下游引物,再运用NCBI中的序列比对软件Blast检验所设计引物的特异性,无误后交由上海生工生物工程股份有限公司进行引物合成,引物信息见表1。将检测合格的DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,并将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行一代正向测序,测序结束后,用Chromas和DNASTAR软件打开测序结果,将测序结果与AGT基因rs5046、rs2148582位点的标准序列进行比对,逐一观察相应测序峰型,确定其单核苷酸多态性(SNP)。测序结果异常者可再次进行PCR扩增、正向测序,再进行序列比对。PCR反应体系(PCR Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL)、AGT rs5046、rs2148582 位点扩增条件:(1)预变性94 ℃ 4 min；(2)变性94 ℃ 30 s,复性60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,循环35次；(3)终延伸72 ℃ 10 min。

表1 PCR引物序列

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件对数据进行统计处理和分析,使用基因计数法计算并分析两组的基因型及等位基因频率,计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验；使用哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg)检验对研究对象是否来自同一孟德尔群体进行验证,若P>0.05说明研究对象具有群体代表性;采用χ2检验分析AGT基因多态性与房颤的相关性,用OR值和95%可信区间(95%CI)来表示房颤与主要危险因素的关联强度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DNA纯度及水平的检测结果 提取208份标本的DNA后,用紫外分光光度仪测得所有标本的DNA水平均为100～300 ng/μL,DNA水平过高的标本通过TE Buffer稀释到100 ng/μL后再进行PCR扩增。用A260与A280的比值来评估DNA纯度,所有标本纯度均为1.8～<2.0,结果良好,可用于后续试验。

2.2AGT基因rs5046、rs2148582位点PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 DNA扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳特异性验证,得到扩增产物:rs5046位点扩增产物大小为197 bp、rs2148582位点扩增产物大小为270 bp,所有标本的电泳图均呈现一条亮带。见图1。

注:A为rs5046；B为rs2148582；M为标记物。

图1 rs5046、rs2148582PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图

2.3AGT基因rs5046、rs2148582位点基因分型测序 经PCR扩增、琼脂糖凝胶试验验证、紫外凝胶成像系统照相后,对房颤组和对照组进行一代测序。rs5046、rs2148582位点两个多态性位点的基因分型测序图见图2。

注:A为rs5046位点为野生型CC(35号标本)；B为rs5046位点为杂合型CT(41号标本)；C为rs5046位点为纯合型TT(92号标本);D为rs2148582位点为野生型CC(8号标本)；E为rs2148582位点为杂合型CT(69号标本)；F为rs2148582位点为纯合型TT(42号标本)；各多态性位点由箭头标示。

图2 rs5046、rs2148582多态性位点测序图

2.4AGT基因rs5046、rs2148582位点基因分析结果

2.4.1房颤组和对照组Hardy-Weinberg平衡检验 使用群体遗传学Hardy-Weinberg平衡检验分别计算房颤组和对照组人群AGT基因rs5046、rs2148582位点的基因型频率,见表2、3。可见房颤组和对照组两个位点各基因型频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明群体基因符合遗传平衡,样本代表性良好。

表2 房颤组和对照组rs5046位点Hardy-Weinberg平衡检验(n)

表3 房颤组和对照组rs2148582位点Hardy-Weinber平衡检验(n)

2.4.2AGT基因rs5046、rs2148582位点与房颤的遗传易感性 AGT基因rs5046位点杂合型(CT)个体患房颤的风险高于野生型(CC)(OR=2.23,95%CI:1.22～4.08,P=0.009)。纯合突变(TT)个体患病风险是野生型(CC)的4.38倍(95%CI：1.35～14.19,P=0.009)。纯合突变(TT)对房颤的影响大于杂合突变(CT),两种突变都可增加房颤的风险。携带突变等位基因T的个体,其患房颤的风险是野生型等位基因C的2.29倍(95%CI：1.44～3.66,P<0.001)。见表4。AGT rs2148582位点分析结果显示,rs2148582位点房颤组CC基因型频数为56(51.85%)、CT基因型频数为41(37.96%)、TT基因型频数为11(10.19%)；对照组CC基因型频数为60(60.00%)、CT基因型频数为32(32.00%)、TT基因型频数为8(8.00%)。房颤组等位基因C频数为153(70.83%),等位基因T频数为63(29.17%)；对照组等位基因C频数为152(76.00%),等位基因T频数为48(24.00%)。两组间的基因型分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)、等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表4 rs5046位点基因型分布及等位基因频率比较[n(%)]

注：a为本行结果与基因型CC比较，b为本行结果与等位基因C比较。

表5 rs2148582位点基因型分布及等位基因频率[n(%)]

注：a为本行结果与基因型CC比较，b为本行结果与等位基因C比较;-表示该项无数据。

3 讨 论

房颤是一种心律失常性疾病，在心血管疾病中占相当高的比例，该病是由基因及环境因素共同作用的结果。在每年因心血管疾病去世的患者中，房颤患者占相当大的比重，并且有逐年增加的趋势，已引起临床医生的高度重视。在疾病的发生、发展过程中，SNP位点具有重要的作用。SNP是指在基因组中，由于单个核苷酸发生突变引起DNA序列发生改变的一种遗传现象。对基因的SNP进行研究，有助于发现相关疾病的致病基因，从而为疾病的分子及基因靶向治疗提供依据。RAAS中包含有5个基因，分别为AGT、AT2R、ACE、AT1R、和CYP11B2,其中AGT G-6A(rs5050)、M235T(rs699)、A-6G(rs5051)、G-217A(rs5049)等多态性位点与房颤的相关性已有大量报道[4-6],而对AGT rs5046和rs2148582位点与房颤的相关性研究较少。rs5046位点是AGT基因上游调控区的一段碱基序列，而rs2148582位点位于AGT基因的内含子区，研究表明这两个位点存在连锁不平衡，因而本研究将这两个多态性位点作为研究目标,探讨其与房颤在分子遗传学上的相关性,从而为临床对房颤的靶向治疗提供参考依据。本研究结果显示: 对于rs5046位点，基因型CC、CT以及TT的分布差异有统计学意义(P<0.05)，且等位基因C与T的频率在房颤组和对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),杂合突变(CT)个体患房颤的风险高于野生型(CC)(OR=2.23,95%CI：1.22～4.08,P=0.009)。突变纯合型(TT)个体患病风险是野生型(CC)的4.38倍(95%CI：1.35～14.19,P=0.009)。纯合突变(TT)和杂合突变(CT)均增加了房颤的风险，但纯合突变(TT)增加的风险更大。突变型等位基因T的携带者较野生型等位基因C的携带者而言,其房颤的发病风险是后者的2.29倍(95%CI：1.44～3.66,P<0.001)。

关于rs5046位点的多态性位点与原发性高血压相关性的研究有许多,但该位点与房颤是否相关，仍不确定，因而笔者的研究结果可为临床对房颤的诊断及治疗提供一定的参考意见。PAILLARD等[7]的研究结果表明,C532T多态性位点属于转录因子AP-2的一段序列，它存在完全的连锁不平衡状态，并起着调控AGT基因转录的作用，而这一观点同时被SEIDLEROV等[8]的研究证实。LI等[9]和GU等[10]2015年对我国云南省的少数民族进行研究，其研究对象为彝族和哈尼族，研究选取了AGT的7个多态性位点进行研究，其研究方法为聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析，研究发现， rs5046位点的T等位基因增加了哈尼族人群罹患高血压的风险以及血压水平；rs2148582位点位于AGT基因的第1个内含子区,研究尚未发现rs2148582位点的基因多态性与房颤发病风险具有相关性,在对照组和房颤组中，该位点的等位基因频率和各基因型的分布差异无统计学(P>0.05)。查阅文献后发现关于rs2148582位点多态性的研究较少,孔祥东等[11]的研究结果显示，rs2148582位点多态性与高血压的发病风险并不相关,而宋婷婷[12]的研究中，对原发性高血压患者rs2148582位点的多态性采用多重高温连接酶技术(imLDR)进行检测，结果表明，AGT基因rs2148582位点与原发性高血压的发病相关。这一问题的结论不一致，仍有待后续研究。