PLCE1蛋白在食管鳞状细胞癌及正常食管鳞状上皮中的表达情况及意义

郑淑妍,刘俊斌,苏少雪,李锐凯,林锦銮,杨立业

南方医科大学附属潮州市中心医院:1.病理科；2.胸外科；3.中心实验室,广东潮州 521000

食管癌作为中国六大常见恶性肿瘤之一,病死率位居恶性肿瘤的第4位[1],由环境和多基因遗传等多种因素导致[2]，在中国呈现明显的地域分布差异,高发区主要集中在中西部[3-4],只有广东潮汕地区地处中国南部和沿海地区。在该地区,关于CD44及CD44v6在食管癌、癌前食管和胚胎食管中的表达情况及意义,本课题组前期已采用免疫组织化学染色的方法进行了相关研究,结果提示其与肿瘤的发生、发展及分化程度有关[5-7]。

近年来,有报道指出磷脂酶Cε1基因(plce1)是中国食管癌的易感基因[8-9]。研究发现,PLCE1蛋白在食管鳞状细胞癌(ESCC)中表达明显高于正常的食管鳞状上皮,提示PLCE1蛋白可能参与ESCC癌变的发生与发展[10-12]。然而,潮汕地区关于ESCC与PLCE1蛋白表达情况关联性的报道较少。本研究采用免疫组织化学染色的方法检测本院潮汕籍食管癌患者手术切除标本和非肿瘤患者内窥镜活检食管鳞状上皮PLCE1蛋白的表达情况,进一步探讨其与ESCC的发生、发展的相关性,以期为食管癌的发生、发展，干预及临床治疗提供一个新靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院病理科2010-2018年收治的术前未接受放、化疗的潮汕籍食管癌患者手术切除标本及非肿瘤患者内窥镜食管黏膜组织活检存档蜡块作为研究对象,其中正常鳞状上皮49例(A组，男30例,女19例,年龄25～78岁)，癌旁正常鳞状上皮73例(B组，男35例，女38例，年龄45～78岁)及ESCC组织113例(C组，男85例、女28例,年龄43～80岁)。本研究已获得潮州市中心医院伦理委员会批准同意。

1.2方法

1.2.1石蜡切片 将收集蜡块(蜡块标本均由10%中性甲醛固定,常规脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋)切片2张(厚度4 μm),裱于黏附载玻片上(载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司),其中1张用于HE染色,另1张用于免疫组织化学染色。

1.2.2免疫组织化学染色 采用PV-9000二步法(非生物素)进行免疫组织化学染色。采用已知阳性片(石蜡包埋胎盘组织)作为阳性对照,用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,DAB显色,苏木素复染,光镜观察。一抗PLCE1为兔抗人/鼠多克隆抗体,购自GeneTex公司(Catalog Number.GTX105168)。浓缩液在预实验中分别按照1∶100、1∶200、1∶400及1∶800的比例进行稀释,比较其表达效果,取最佳比例1∶100进行后续操作。免疫显色试剂及DAB染色液购自上海杰浩生物技术有限公司,严格按照试剂盒操作说明书操作。具体步骤如下，(1)脱蜡和水化:石蜡切片置入脱蜡液脱蜡,梯度酒精水化；(2)抗原修复:将切片置入已煮沸的乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)缓冲液中,高压锅加压5 min,冷却至室温；(3)3%H2O2室温孵育10 min,PBS洗涤3次,每次3 min；(4)除去组织上的PBS溶液,37 ℃条件下滴加一抗孵育60 min,PBS洗涤3次,每次3 min；(5)37 ℃条件下滴加二抗孵育30 min,PBS洗涤3次,每次3 min；(6) DAB(0.04%)显色(镜检控制)、水洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。

1.3结果判断 PLCE1蛋白定位于细胞质和(或)细胞膜,呈淡黄至棕褐色颗粒,参照文献[7]进行结果判定,根据染色强度及阳性细胞数量分为:“-”“+”“++”“+++”。细胞不着色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数<5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；阳性细胞数>25%～50%为2分；阳性细胞数>50%～75%为3分；阳性细胞数>75%为4分。将染色强度的得分加上阳性细胞数的得分为总分,总分0～1为“-”、2～3为 “+”、4～5为“++”、6～7为“+++”。所有结果判断均由两名病理科主治医师共同进行判断。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件对数据进行处理及分析,计数资料以例数或率表示，对于各组之间表达强度的数据统计采用独立样本非参数检验:Kruskal-WallisH检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果 PLCE1蛋白在ESCC组织、癌旁正常鳞状上皮及非肿瘤患者正常食管鳞状上皮中的表达均定位于细胞质和(或)细胞膜中,呈淡黄至棕褐色颗粒,见图1～2。

注：A、B、C、D表达强度分别为+++、++、+及-。

图1 PLCE1蛋白在ESCC组织中的表达情况(×200)

注：A、B、C、D表达强度分别为+++、++、+及-。

图2 PLCE1蛋白在正常食管鳞状上皮中的表达情况(×200)

2.2PLCE1蛋白在不同食管组织中的表达特征 在非肿瘤患者正常食管鳞状上皮及ESCC患者癌旁正常鳞状上皮中，PLCE1蛋白均主要表达于上皮的表面细胞层及棘层,基底层不表达或弱表达,阳性率分别为89.8%(44/49)和69.9%(51/73)。PLCE1蛋白弥漫表达于肿瘤细胞中,阳性率为77.0%(87/113)。

2.3PLCE1蛋白在不同食管组织中的表达情况 3组不同组织PLCE1蛋白的表达情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。其中A组PLCE1蛋白阳性情况与B组和C组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)，B组与C组之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PLCE1蛋白在非肿瘤患者正常食管鳞状上皮、肿瘤患者癌旁正常鳞状上皮及ESCC组织中的表达情况[n(%)]

3 讨 论

plce1基因位于人第10号染色体上,PLCE1蛋白是其编码的磷脂酶C家族的重要成员之一,具有位于C端的Ras结构域。plce1基因参与细胞信号传导及基因表达的调控,影响细胞的生长、分化、凋亡及血管形成等[4]。以往研究发现,PLCE1蛋白在ESCC组织中的表达明显低于正常的食管鳞状上皮,提示其可能影响ESCC的发生与发展过程[10-12],但与肿瘤TNM分期的相关性则结论不一。也有研究表明，PLCE1蛋白在胃癌组织中的表达同样显著高于正常的胃黏膜,且在胃癌组织中高表达与不良预后相关[14]。另有报道称,PLCE1蛋白在肝癌和结肠癌组织中的表达量显著低于正常肝细胞及肠黏膜,且低表达提示预后不良[15-16],高表达明显抑制肿瘤的浸润及提高肿瘤的分化程度,提示plce1基因可能为结肠癌的抑癌基因。

本研究结果显示，非肿瘤患者正常食管鳞状上皮PLCE1蛋白的表达量高于ESCC组织和癌旁正常鳞状上皮,同时呈现递减趋势,这与CHENG等[15]、OZTAS等[16]的报道相似。且在正常鳞状上皮中,PLCE1蛋白主要表达于上皮的表面细胞层及棘层,基底层不表达或弱表达。ESCC患者癌旁正常鳞状上皮和癌细胞间PLCE1蛋白的表达差异则无统计学意义(P>0.05)。PLCE1蛋白在正常鳞状上皮、癌旁鳞状上皮及ESCC组织中的表达差异,提示其可能与癌症发生和发展有关；其在非肿瘤正常鳞状上皮中表达较肿瘤组织高,且PLCE1蛋白在上皮的基底层弱表达或不表达。而基底层作为上皮的生发层,具有较高的增殖潜能,在上皮来源肿瘤的发生、发展中具有重要作用。PLCE1蛋白在基底层低表达的这一特征,进一步提示其高表达可能是通过改变Ras信号通路中的某些物质,从而抑制细胞的增殖并促进细胞的成熟和分化,在肿瘤的形成过程中起到抑制作用。而本课题组前期的研究发现CD44和CD44v6在食管黏膜中主要表达于上皮的基底层[5-7],而在癌组织中的表达高于正常黏膜,这与PLCE1蛋白的表达情况恰好相反,有望将其联合应用于食管癌发病机制及早期筛查和治疗的研究中。此外,PLCE1蛋白在ESCC中的低表达,可能影响了Ras受体促进肿瘤细胞凋亡的通路,从而间接促进了肿瘤的发生,这与CHENG等[15]，OZTASE等[16]在肝癌和结肠癌中的研究报道较为相近,而与张晓娟等[13]在ESCC中的报道有所差异,进一步提示作为ESCC高发区之一的潮汕地区,可能有着自身独特的遗传基因。这将为进一步研究潮汕地区ESCC的防治提供一个新的筛选靶点。