高分辨熔解曲线分析CYP3A5基因多态性方法学的建立

2020-02-13 06:14钟巧玲范雪娇何文茵
检验医学与临床 2020年3期
关键词:克莫司基因型基因组

钟巧玲,范雪娇,何文茵,李 磊△

1.广州医科大学金域检验学院,广东广州 510182;2.广州医科大学附属第三医院检验科,广东广州 510150

他克莫司是大环内酯类抗菌药物,也是钙调磷酸酶抑制剂,作为一线免疫抑制剂,广泛应用于器官移植术后抑制免疫排斥、自身免疫性疾病治疗等领域。他克莫司的药物作用机制是通过特异性结合细胞内他克莫司结合蛋白-12(KFBP-12),选择性抑制钙调磷酸酶,从而抑制T淋巴细胞活化和Th细胞依赖型B细胞的增殖,起到全面抑制T淋巴细胞的作用。虽然该药功效良好,但是存在较大的个体差异,使用相同剂量他克莫司的不同人群血药浓度间存在明显差异;并且用药量不足会导致治疗效果不佳,药物过量则会导致机体产生不良反应[1-3]。虽然能通过对患者进行血药浓度的监测来调整用药剂量,但此做法存在滞后性,对于器官移植初期的患者来说,不能及时调整用药剂量是极为危险的。

现有研究表明,CYP3A5基因多态性对他克莫司在体内的药物代谢过程有明显影响,其中rs776746 (CYP3A5*3,6986A>G)单核苷酸多态性(SNP)影响最大,在中国汉族人群中,该位点的突变频率高达72.17%[4-5]。人类CYP3A5基因位于7q22.1,长度为31.8 kb,有13个外显子,能够编码502个氨基酸。CYP3A5基因的第3内含子存在6986A>G的突变,该位点由A突变为G会产生一个隐含的酶切位点,异常的剪切导致终止密码子(PTC)提前出现,突变型CYP3A5 mRNA由于过短剪切,比野生型降解更迅速、更不稳定,所产生的“不完整”的CYP3A5蛋白酶活性大大降低甚至消失。因此CYP3A5*3/*3型(突变型GG)患者体内他克莫司代谢缓慢,早期应给予低剂量,避免出现药物不良反应,而与CYP3A5*3/*3型患者相比,CYP3A5*1/*1型(野生型AA)和CYP3A5*1/*3型(杂合型AG)患者则需要服用较大剂量的他克莫司才能达到相同的血药浓度。

因此,根据CYP3A5基因型调整用药比传统的经验性给药方案更加安全,对于早期快速、有效指导他克莫司个体化用药,预防器官移植后免疫排斥反应具有重要意义。本研究目的是建立灵敏度高、特异性强的高分辨熔解曲线(HRM)方法,用于检测CYP3A5 SNP位点(rs776746)以确定CYP3A5位点的具体基因型,从而为他克莫司的个体化用药提供一种快速简便的评估方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2019年3月于广州医科大学附属第三医院就诊,以他克莫司为主要免疫抑制剂的20例肾移植患者,其中男11例、女9例,年龄26~88岁,收集其抗凝全血标本,用于提取患者的基因组DNA进行后续的SNP检测及序列分析。

1.2仪器与试剂 针对CYP3A5 SNP(rs776746)等位基因设计的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。CYP3A5 SNP等位基因的HRM检测采用血液基因组DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司,DK601)和HRM分析试剂盒(天根生化科技有限公司,FP210),检测仪器为Roche LightCycler z480荧光实时定量PCR仪。测序相关试剂包括PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara公司,R050A)以及琼脂糖凝胶电泳、测序分析常用试剂,检测仪器包括ABI veriti PCR仪、JUNYI电泳仪、BIO-RAD凝胶成像系统、ABI 3500XL基因测序仪,序列分析由艾基生物测序公司完成。

1.3方法

1.3.1引物的设计及最佳引物的选取 参照GenBank(Access No.NT_007933)中CYP3A5基因序列,使用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物,针对CYP3A5*3 SNP位点设计4对引物,用以鉴别CYP3A5 3种基因型。利用测序方法确定的已知基因型标本作为测试对象,进行HRM分析,根据不同基因型之间的分离度选取最佳引物。

1.3.2基因组DNA提取 按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,取200 μL EDTA-K2抗凝全血至EP管中,加入蛋白酶K和细胞裂解液GL,振荡混匀,56 ℃温育10 min后加缓冲液GB,转入吸附柱进行离心,用WAG、WB1漂洗,最后用30 μL TE缓冲液洗脱DNA。Nanodrop2000超微量分光光度计测定所提取DNA的水平和纯度,基因组DNA标本放置在-20 ℃冰箱内保存,用于后续试验。

1.3.3HRM方法检测CYP3A5 SNP位点 将提取的基因组DNA,应用HRM分析试剂盒检测CYP3A5 SNP位点,扩增体系均为20 μL,反应条件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,40个循环;收集熔解曲线信号参数。根据已知基因型标本的熔解曲线,仪器自动判断待检标本的基因型。

2 结 果

2.1引物设计及验证 参照GenBank中CYP3A5基因序列设计4对特异性引物,分别对不同基因型的标本进行HRM试验,通过对比它们的分离度分析引物特异性,选取其中对于不同基因型分离度最好的一对引物进行后续试验,其上游引物为5′-TGTACCACCCAGCTTAACGA-3′,下游引物为5′-AAGAGTCTCACACAGGAGCC-3′。

2.2HRM方法检测CYP3A5 SNP位点 利用基因测序方法确定CYP3A5 SNP位点的突变情况,并使用上述引物及试剂采用HRM方法进行检测,结果表明HRM方法可以区分CYP3A5 SNP位点的3种突变类型,见图1。

注:A为熔解曲线;B为熔解曲线差值变换。

图1 HRM方法检测CYP3A5 SNP3种突变类型的结果

2.3HRM方法的正确度验证 采用HRM方法检测20例标本CYP3A5 SNP基因型,结果见图2。仪器未自动判读的基因型通过曲线形状进行人工判读,将HRM方法与DNA测序法的结果进行比较,两种方法检测的结果全部相符,符合率为100%,其中有2例为人工判读。

2.4HRM方法检测CYP3A5 SNP位点的灵敏度及重复性验证 以CYP3A5位点野生型(AA型)为Base curve(基线),在相同上样量(1 μL)的条件下,对不同水平的CYP3A5 SNP/*3突变型核酸样品(GG型)采用HRM方法进行分析,峰型越高说明区分度越高,结果显示,即使基因组DNA水平降低到1 ng/μL,仍可被HRM方法有效检出。见图3。此外,为了检测该方法的稳定性,以HRM方法对CYP3A5位点的3种标本(AA、AG、GG)重复检测3次,检测共进行5 d,检测结果与预期结果完全一致,重复性良好(结果未列出)。

注:A为溶解曲;B为熔解曲线差值变化。

图2 HRM方法检测20例全血标本CYP3A5 SNP位点

图3 CYP3A5 SNP GG型灵敏度检测

3 讨 论

CYP3A5是细胞色素酶P450家族中的重要成员,SNP可导致药物在人体内代谢情况出现不同,肾移植患者术前通过CYP3A5基因型检测可预测他克莫司达到稳态时的起始剂量,有效预防相关并发症发生。多项研究表明,不论是移植患者还是其他免疫疾病用药患者,当服用同等剂量的他克莫司时,携带CYP3A5*3等位基因患者的血药浓度较携带CYP3A5*1等位基因患者明显升高[6-8]。此外,CYP3A5参与盐酸泰勒地平、阿哌沙班、西洛他唑等多种药物的体内代谢,其基因多态性同样影响其他药物的体内代谢情况[9-12]。

HRM方法广泛用于SNP位点的检测,熔解曲线变化速率取决于其扩增序列,序列中任何一个碱基的差异都可导致双链DNA的解链温度发生变化。HRM方法应用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化,确定所扩增的目的片段中是否存在突变,从而用于基因分型。该方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确,有利于实现闭管操作,但对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。

本研究建立了一种检测CYP3A5基因多态性的HRM分析方法,并证实该方法与测序结果完全一致。HRM方法的灵敏度和重复性验证结果表明,该方法灵敏度高、稳定性好。HRM作为一种快速准确、自动化筛查DNA突变的技术,以其高特异度、高灵敏度、高通量及价格低的优点得到了临床日益广泛的应用,该方法操作简单,适宜在临床工作中开展。通过HRM方法对肾移植患者CYP3A5这一位点进行检测将有助于预估移植初期患者服用他克莫司的起始剂量、有助于医师调整他克莫司的血药浓度,实现免疫抑制剂个体化应用,有效改善器官移植预后。

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