丙酮酸脱氢酶激酶4在膀胱癌化疗耐药中的作用

肖 德

重庆市第七人民医院泌尿外科，重庆 400054

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，一旦患病将严重影响患者的生活质量。化疗是治疗膀胱癌的重要方法之一，但是在长期的化疗过程中，肿瘤细胞会产生耐药性，从而导致治疗失败。而当肿瘤细胞出现化疗耐药后，其生物学行为也会发生变化，进而影响膀胱癌的临床疗效，促使肿瘤复发与恶化[1]。丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在哺乳动物中存在4 种异构体，分别为PDK1、PDK2、PDK3 和PDK4，其中PDK4在多种组织中呈高表达[2]，且PDK4已被证实是丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)调控物质代谢的中心，是丙酮酸氧化和体内葡萄糖维持平衡的关键调节因子[3]。本文拟就PDK4在膀胱癌化疗耐药中的表达情况及作用进行研究报道，以期为临床膀胱癌治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 RPMI 1640培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自Sigma公司；青链霉素双抗购自PAN-biotech 公司；PKD4 siRNA 及其阴性对照(健康细胞)由金斯瑞生物科技有限公司提供；总RNA 提取试剂盒、反转录及实时荧光定量PCR 试剂盒、双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒、细胞抗凋亡蛋白(Bcl-2蛋白)和β-actin鼠多克隆抗体均来自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞的培养 实验中用到的人膀胱癌耐药细胞系253J/DOX，其中人膀胱癌253J细胞系由本实验室建立，由10%胎牛血清、青链霉素双抗的RPMI 1640培养液常规培养后获得，在253J/DOX耐药细胞培养液中加入0.5 mg/mL的多柔比星，并加入1.0 mg/mL的长春新碱来维持其耐药性[4]。

1.2.2细胞的转染 用胰蛋白酶来消化253J/DOX细胞，按照转染试剂盒的说明书进行操作，采用2 μg PKD4 siRNA-1、PKD4 siRNA-2、PKD4 siRNA-3和阴性对照(不沉默PKD4的siRNA)分别转染253J/DOX细胞。48 h后，按照提取细胞总RNA的操作进行RNA提取，并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞中PKD4的表达情况，用以验证PKD4 siRNA-1、PKD4 siRNA-2、PKD4 siRNA-3的干扰效果[5]。

1.2.3qRT-PCR分析PKD4的表达[6]为干扰PKD4的表达，将siRNA转染至253J/DOX膀胱癌耐药细胞中，并通过qRT-PCR检测干扰效果。按照试剂盒说明书进行操作：提取细胞总RNA，同时加入PCR产物，加入缓冲液(6×Loading Buffer)，标本混匀后放入电泳胶孔[7]。PCR反应条件[7]：95 ℃预变性7 min；变性95 ℃ 40 s，退火52 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 2 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增后采用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物。控制电泳电压为100 V，将电泳凝胶放入凝胶成像系统观察并记录结果，计算PKD4 RNA的相对表达量。

1.2.4噻唑蓝(MTT)法检测体外药物灵敏度[8-9]将253J/DOX细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，用X-tremeGENE转染试剂将PKD4 siRNA 和生理盐水(阴性对照组)分别转染253J/DOX细胞。常规培养48 h后，每孔加入新鲜配制的5 μg/mL MTT溶液20 μL，然后继续培养4 h。终止培养后去除上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min后，波长490 nm处检测吸光度(A)值，测定3个重复孔取平均值，计算细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。并计算细胞的半抑制浓度(IC50)。

1.2.5流式细胞仪测定细胞凋亡 将253J/DOX细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，采用转染剂分别将不同种类的siRNA转染入253J/DOX细胞。转染24 h后，加入50 μg/mL 的多柔比星。常规培养48 h后收集细胞，并采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3 次，然后采用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡率[8]。细胞凋亡率= (早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100%。

1.2.6蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后Bcl-2蛋白表达变化[7]采用转染剂分别转染PKD4 siRNA和阴性对照组(健康细胞)的253J/DOX细胞，样品加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，按0.1 mL/cm2的规格加入封闭液封闭1 h，加入一抗后4 ℃过夜。次日TBST漂洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h，ECL显色。进行电泳，计算Bcl-2蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1PKD4在膀胱癌细胞中的表达水平 qRT-PCR 结果显示，PKD4在253J/DOX膀胱癌耐药细胞中表达量(122.5±12.5)明显高于人膀胱癌253J细胞系(1.22±0.11)，差异有统计学意义(t=55.265，P<0.05)。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3分别下调PKD4表达水平至阴性对照组的(0.95±0.19)倍、(0.88±0.16)倍和(0.66±0.11)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA-3干扰PKD4表达效果较好，后续实验将采用siRNA-3干扰PKD4表达。

2.2干扰PKD4后膀胱癌细胞体外药物灵敏度的变化 通过转染siRNA 降低253J/DOX细胞中PKD4的表达水平，PKD4-siRNA-3 组与阴性对照组DOX的IC50比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PKD4-siRNA-3组与阴性对照组多柔比星的IC50比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 干扰PKD4后膀胱癌细胞体外药物灵敏度的变化

2.3干扰PKD4后化疗药物诱导细胞凋亡的变化 通过流式细胞仪检测PKD4-siRNA-3组与阴性对照组的细胞凋亡，在多柔比星的诱导下，PKD4 siRNA-3组的253J/DOX细胞凋亡率为(39.1±2.9)%，明显高于阴性对照组的(14.7±1.5)%，差异有统计学意义(t=45.695，P<0.05)。

2.4干扰PKD4后Bcl-2蛋白表达的变化 Western blot结果显示，siRNA-3降低253J/DOX细胞PKD4的表达水平后，Bcl-2蛋白的表达量为(15.8±1.5)，与阴性对照组(74.5±12.3)相比，差异有统计学意义(t=65.984,P<0.05)。

3 讨 论

膀胱癌化疗耐药是导致膀胱癌高病死率的一个重要原因，具体是指除对最初使用的诱导药物有抗药性之外，对其他未接触过的多种药物均具有耐药性[10-11]。许多耐药相关蛋白不仅在肿瘤细胞中表达，在正常组织中也会表达，但只有肿瘤组织中表达的耐药蛋白才是研究的重点。PDK4蛋白在饥饿状态，或供能物质由葡萄糖变为脂肪酸的条件下表达会增加。

本研究通过体外化疗药物进行阶梯性诱导，以人膀胱癌的253J细胞为亲本细胞系，选择稳定的膀胱癌耐药细胞系253J/DOX进行试验，这一细胞系对多柔比星化疗药物的耐受性明显增强。为了确定PKD4在膀胱癌耐药中的作用，本实验首先通过qRT-PCR测定PKD4在253J/DOX的表达水平，结果显示，PKD4在253J/DOX中表达明显升高，这说明PKD4与DOX类药物的耐药有关。通过siRNA干扰降低PKD4的表达，然后进行MTT试验，结果显示PKD4表达水平明显降低，提示siRNA可改善253J/DOX细胞对DOX和多柔比星的耐药性，而对DOX耐药性的影响更为明显，流式细胞仪检测的结果显示这种耐药性的改变与化疗药物引起的细胞凋亡增加有关。

有研究显示以不同浓度的姜黄素作用于膀胱癌T24细胞，采用MTT法检测细胞增殖抑制率，Transwell法实验观察T24细胞侵袭能力的变化，Western blotting检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的差异，结果均说明姜黄素可有效抑制T24细胞的增殖，并抑制T24细胞的体外侵袭能力[12]。也有研究显示砷可降低小鼠肝脏和肝细胞中PDK4的表达，降低BRD对PDK4的诱导作用，砷引起异常镇压组蛋白修饰沉默[1]。但是关于PDK4对Bcl-2蛋白表达的影响报道较少，Bax基因属于Bcl-2基因家族，Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2蛋白产生抑制作用[13]。本研究通过Western blotting说明干扰PKD4可以下调Bcl-2蛋白的表达，进一步证实了PKD4可以通过调控Bcl-2进而影响膀胱癌的耐药性。然而，Bcl-2蛋白的表达是否由PKD4直接调控或影响，以及PKD4在膀胱癌耐药机制信号通路中的作用，仍需要进一步研究。有研究显示，LRIG3基因过表达可影响膀胱癌耐药细胞株对顺铂的灵敏度，靶向沉默miRNA-21表达能明显降低膀胱癌细胞的增殖及侵袭能力，其机制与抑制Notch1信号通路有关[14]。本研究通过对膀胱癌化疗耐药细胞PKD4表达情况进行分析，为膀胱癌化疗耐药性的研究提供了一定参考。

综上所述，PKD4在膀胱癌化疗耐药细胞中的表达明显升高，干扰PKD4表达可明显影响膀胱癌耐药，可考虑将PKD4作为治疗膀胱癌化疗耐药的重要分子靶标。