ARMCX1对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响*

肖 莉，高 月，马秀洁，孙雪竹，李亚娟，曹芳蕾，范 雪

(1 锦州医科大学附属第三医院妇产科， 辽宁 锦州 121001； 2重庆市北碚区中医院检验科， 重庆 400700)

含Armadillo重复序列X连锁蛋白1(Armadillo repeat-containing X-linked protein 1, ARMCX1)是ARM蛋白家族的成员之一。研究显示在人类多种正常组织中ARMCX1的mRNA水平表达增高而在肿瘤组织和肿瘤细胞株中却低表达[1]。研究也证实ARMCX1蛋白水平在乳腺癌组织中低表达，而在正常乳腺组织中高表达[2-4]。曾帆等[5-6]的研究却发现ARMCX1蛋白水平在宫颈癌组织中高表达而在正常宫颈组织中低表达。ARMCX1在不同的肿瘤中蛋白水平表达不同，在不同的肿瘤中很可能发挥着不同的作用。因此，我们猜测ARMCX1在宫颈癌中很可能作为一种癌基因发挥重要作用。我们以宫颈癌细胞SiHa为研究对象，探讨ARMCX1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响，为深入研究ARMCX1在宫颈癌发病机制中的作用提供依据。

材 料 和 方 法

1 材料

人宫颈癌SiHa细胞购自ATCC。DMEM培养基和胎牛血清购自Invitrogen；鼠抗人细胞周期蛋白E(cyclin E)、细胞分裂周期蛋白25A (cell division cycle 25A,Cdc25A)、Bcl-2、Bax和ARMCX1单克隆抗体及兔抗人β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz；抗active caspase-3抗体购自Abways；siRNA由上海吉玛公司合成。3条沉默ARMCX1的siRNAs和对照序列(RNAi-Con)如下：RNAi-1为5′-CCUGGAGCGAACAAAUGAUTT-3′(正义链)和5′-AUCAUUUGUUCGCUCCAGGTT-3′(反义链)；RNAi-2为5′-GCCUGCUACUGUGUAUACATT-3′(正义链)和5′-UGUAUACACAGUAGCAGGCTT-3′(反义链)；RNAi-3为5′-GCUGGGCUAAGACUGUUAATT-3′(正义链)和5′-UUAACAGUCUUAGCCCAGCTT-3′(反义链)；RNAi-Con为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ (正义链)和 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (反义链)。

2 方法

2.1细胞培养 SiHa细胞在含10% FBS的DMEM培养液，放置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。待细胞融汇至70%～80%，生长良好用于实验。

2.2小干扰RNA转染SiHa细胞 将SiHa细胞培养至对数生长期，按每孔1×105个细胞加入6孔板，待密度约50%，按Lipofectamine 2000说明书转染细胞48～72 h。细胞分为对照(RNAi-Con)组和实验(RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3)组，利用real-time PCR和Western blot检测ARMCX1的表达水平，以确定其中一条沉默效果好的siRNA进行后续实验。

2.3细胞转染 转染前将SiHa细胞制成悬液，接种于6孔板中。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。当细胞融汇至50%～60%时，加入8 μL的siRNA溶液和4 μL Lipofectamine 2000，再加入10%胎牛血清的DMEM培养基到2 mL培养48 h。实验共分为NC-control组和siRNA-ARMCX1组。

2.4平板集落形成实验 将转染后的SiHa细胞制成细胞悬液(1×106个/L)，以每孔500个的浓度加入12孔板，轻轻混匀，隔2 d换次培养液。孵育10 d，PBS缓冲液清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS缓冲液清洗3次，用0.2%结晶紫染色液染色10 min，计数集落数目，上述实验重复3次。

2.5流式细胞术检测细胞周期分布 siRNA转染SiHa细胞48 h后，胰酶消化后离心，收集细胞，PBS缓冲液冲洗2遍，离心弃上清，缓慢加入体积分数75%的冷乙醇2 mL固定，4 ℃过夜；细胞密度调整为5×108～1×109个/L，PBS缓冲液重悬后加碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液1 mL，避光15 min，流式细胞术检测分析各组细胞的DNA含量，上述实验重复3次。

2.6流式细胞术检测细胞凋亡 siRNA转染SiHa细胞48 h后，胰酶消化后离心，收集细胞，PBS缓冲液冲洗2次，离心弃上清，再加入1 mL PBS混匀，再加入5 μL annexin V-FITC，振荡混匀，4 ℃孵育15 min加入5 μL PI，孵育5 min，流式细胞术检测细胞凋亡情况，上述实验重复3次。

2.7Western blot 检测各细胞周期和凋亡相关蛋白的水平 收集转染siRNA 48 h后的SiHa细胞。提取总蛋白，测定蛋白浓度。用8% SDS-PAGE进行分离后，将目的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加 I 抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5次，加入 II 抗室温再孵育2 h，ECL化学发光，检测蛋白表达水平。以β-actin作为内参照，各组蛋白表达水平=各目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

3 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，利用t检验统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 RNAi效率的检测

将RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3及RNAi-Con序列分别转染SiHa细胞，48 h后收集细胞,real-time PCR检测ARMCX1的mRNA表达量，72 h后收集细胞用Western blot检测ARMCX1蛋白的表达量。结果显示RNAi-3序列沉默ARMCX1效果明显(P<0.01)，用于后续实验，见图1。将RNAi-3命名为siRNA-ARMCX1，对照组命名为NC-control。

Figure 1. The silencing ofARMCX1in SiHa cells transfected with siRNAs. A: the mRNA expression of ARMCX1 detected by real-time PCR; B: the protein expression of ARMCX1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRNAi-Con group.
图1 小干扰RNA转染SiHa细胞后ARMCX1的表达

2 siRNA转染后SiHa细胞集落形成能力的改变

利用平板集落形成实验观察敲减ARMCX1表达对SiHa细胞集落形成能力的影响，结果显示实验组SiHa细胞的集落形成数目明显少于对照组(P<0.05)，见图2。

3 siRNA转染后SiHa细胞周期分布的变化情况

敲减ARMCX1表达的SiHa细胞其细胞周期被阻滞在S期，见图3。

4 siRNA转染后SiHa细胞凋亡变化情况

敲减ARMCX1表达的SiHa细胞其凋亡细胞数量明显增多(P<0.05)，见图4。

5 siRNA转染对SiHa细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

敲减ARMCX1表达的SiHa细胞中cyclin E和磷酸化Cdc25A的蛋白水平降低,Bcl-2蛋白表达量显著减少，active caspase-3的蛋白水平显著增加(P<0.05),见图5。

讨 论

ARM家族蛋白是一类含有Armadillo重复序列结构的蛋白。Armadillo重复序列结构首次在果蝇极性基因中发现，对果蝇胚胎和早期细胞极性形成以及维持上皮组织完整性具有重要作用[7]。ARMCX1蛋白是ARM蛋白家族的成员。生物信息学提示,ARMCX1基因位于Xq21.33-q22.2，其蛋白被一个外显子编码而且具有2个Armadillo重复序列结构[1, 8-9]。近年来研究发现，在心脏、结肠、前列腺、脑和卵巢等大多数正常组织中ARMCX1表达呈高水平而在胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌组织中低表达，在肺癌、结肠癌和前列腺癌组织中没有表达[1-3, 10-11]。但也有文献发现ARMCX1在宫颈癌组织中高表达而在正常宫颈组织中低表达[5-6]。与之前的学者研究发现有所不同。我们猜测ARMCX1在宫颈癌中可能作为一种癌基因发挥重要作用。因此，我们以宫颈癌细胞SiHa为研究对象，探讨ARMCX1对宫颈癌细胞增殖和凋亡方面的作用机制，为深入研究ARMCX1在宫颈癌发病机制中的作用提供依据。

Figure 2. The effect ofARMCX1expression knock-down on colony formation of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
图2 敲减ARMCX1的表达对SiHa细胞平板集落形成能力的影响

Figure 3. The effect ofARMCX1expression knock-down on the cell cycle distribution of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
图3 敲减ARMCX1的表达对SiHa细胞周期的影响

Figure 4. The effect ofARMCX1expression knock-down on the apoptosis of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
图4 敲减ARMCX1的表达对SiHa细胞凋亡的影响

Figure 5. The effect ofARMCX1expression knock-down on the protein levels of apoptosis- and cell cycle-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
图5 敲减ARMCX1的表达对SiHa细胞增殖和凋亡相关蛋白水平的影响

已有文献报道，在宫颈癌HeLa细胞中沉默ARMCX1能够抑制宫颈癌细胞的生长，并且细胞周期阻滞在S期[5]。我们的研究也发现在宫颈癌SiHa细胞中敲减ARMCX1的表达后，细胞的集落形成能力受抑制，并且S期细胞明显增多，表明敲减ARMCX1的表达阻滞了SiHa细胞周期进程。cyclin/cyclin依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是调控细胞周期进程的关键大分子，而cyclin E/CDK2是G1/S关键点重要的效应子。在G1/S转化进程中，Cdc25A通过对cyclin E/CDK2的作用促进细胞进入S期，而Cdc25A 表达水平的下降导致细胞周期阻滞在S期[12]。我们的研究发现敲减ARMCX1的表达后，cyclin E和Cdc25A蛋白质表达水平均降低。因此我们猜测敲减ARMCX1的表达很可能直接或间接降低Cdc25A蛋白表达量，进而使细胞周期阻滞在S期。细胞周期被阻滞能够抑制细胞的增殖，最终诱发细胞凋亡。caspase-3是caspase家族的重要成员，在细胞凋亡程序中起最后的枢纽作用[13]，active caspase-3是caspase-3的主要活化形式，具有生物学活性，active caspase-3的表达量可反映细胞凋亡情况。Bcl-2是caspase-3的上游调控蛋白，可抑制active caspase-3的表达，进而抑制细胞的凋亡。而Bax的作用正好相反，它具有促进细胞凋亡的功能[14-18]。本研究结果显示，敲减ARMCX1的表达后凋亡的SiHa细胞数量增加，Bcl-2蛋白表达量减少，而Bax和active caspase-3蛋白量却增加，提示敲减ARMCX1的表达很可能通过增加Bax和active caspase-3 的蛋白表达，降低Bcl-2的蛋白表达，进而抑制细胞增殖，诱导其凋亡。

综上所述，本研究证明在宫颈癌细胞中敲减ARMCX1的表达能够阻滞细胞周期，抑制细胞增殖，进而诱导细胞凋亡，其机制可能与沉默ARMCX1后引起细周期S期的相关蛋白cyclin E和Cdc25A蛋白表达量降低，细胞阻滞在S期，进而抑制细胞增殖。同时，引起Bax和active caspase-3的蛋白量的增加，降低了Bcl-2的蛋白表达，启动内源性凋亡通路引起细胞凋亡。本研究的发现为进一步研究ARMCX1在多种肿瘤发生发展的分子机制提供了依据。