NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与糖尿病导致的肾损伤和脂代谢异常*

朱 艳，梁子辉，任韫卓，吴 明，韩伟霞，肖 夏，杜春阳△

(河北医科大学 1电镜实验中心， 2外科总论与手术学教研室， 3病理学教研室， 河北 石家庄 050017)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病慢性微血管并发症的肾脏表现，逐渐进展可以导致终末期肾功能衰竭，主要表现为肾小管及间质持续进展的纤维化。肾小管上皮细胞的炎症反应及胆固醇代谢紊乱在DN患者的肾小管及间质纤维化的进程中发挥重要作用[1]。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体(inflammasome)是介导机体免疫炎症和细胞死亡的关键调控因子，主要由NLRP3、衔接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain)以及效应蛋白caspase-1、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18组成，在受到相应刺激后,通过NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18轴的逐级活化,在包括2型糖尿病等多种炎症免疫性疾病过程中都发挥了关键作用[2]。胆固醇是NLRP3炎症小体活化的主要刺激因素，低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)能够激活巨噬细胞的NLRP3炎症小体，促进炎症反应[3]。同时，胆固醇也是NLRP3炎症小体活化后最主要的攻击目标。干扰NLRP3基因表达明显延缓了载脂蛋白E缺乏小鼠动脉粥样硬化的进展，抑制了血管壁上的斑块形成[4]。目前，有关NLRP3在糖尿病肾小管细胞胆固醇代谢中的作用尚不明确。本实验将以NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠为研究对象，从整体上观察NLRP3对糖尿病小鼠肾组织炎症及胆固醇代谢的影响，并初步探讨相关机制。

材 料 和 方 法

1 动物

本研究以6～8周龄C57BL/6J背景的野生型(wild-type， WT)小鼠及NLRP3-/-小鼠为动物模型，前者购自北京维通利华实验动物中心(合格证编号为2017-sw0139),后者由深圳华大基因公司采用TALEN技术构建。所有小鼠均在本实验室SPF级实验动物饲养室进行饲养及繁殖，各项动物实验操作均符合河北医科大学实验动物饲养管理条例。

2 实验材料和试剂

兔抗小鼠NLRP3多克隆抗体购自Santa Cruz；兔抗小鼠固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein-2, SREBP-2)、SREBP裂解活化蛋白(SREBP cleavage-activating protein, SCAP)、低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)、ASC、caspase-1、肝X受体α(liver X receptor α, LXRα)和β-actin多克隆抗体购自Abcam；兔抗小鼠IL-1β、IL-18、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗体购自Cell Signaling Technology；油红O购自Sigma；Real-time PCR试剂购自Promega；血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)及24 h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司产品。

3 实验方法

3.1构建动物模型并分组 将实验动物随机分为4组：对照(WT)组、糖尿病(WT+STZ)组、NLRP3基因敲除(NKO)组和NLRP3基因敲除+糖尿病(NKO+STZ)组，每组10只小鼠，其中糖尿病小鼠的构建采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ; 50 mg·kg-1·d-1)，连续注射5 d；对照组小鼠在相同时间注射同体积的枸橼酸盐缓冲液。第5天晚上给小鼠禁食，第6天早8时测定小鼠的空腹血糖及尿糖情况，若血糖≥11.1 mmol/L且尿糖阳性者(+++～++++)确定为糖尿病模型。糖尿病模型建立后8周时用代谢笼收集各组小鼠24 h的尿液标本，随后处死小鼠，迅速股动脉取血，静置10 min后离心分离血清。切取双侧肾脏，取小米粒大小的肾皮质迅速置于2.5%的戊二醛中固定，进行后续的电镜观察；取部分肾皮质置于4%的多聚甲醛中固定, 进行光镜观察；取部分肾皮质直接冻于-20 ℃用于油红O染色；剩余肾组织置于液氮中进行总蛋白质的提取及检测。

3.2血糖及小鼠肾功能的检测 小鼠血糖测定采用罗氏血糖测试仪，取小鼠尾尖血进行测试。肾功能各项指标的检测按照试剂盒说明书进行测定，将工作液和血清或尿液样本按100 ∶1的比例混合均匀后，在Rayto RT-9600半自动生化仪上进行分析。

3.3肾组织HE染色 4%多聚甲醛中固定24 h的各组小鼠的肾组织标本经脱水、透明、浸蜡及包埋后，切成2 μm厚的石蜡切片。切片脱蜡至水，进行HE染色的切片直接苏木素及伊红染色，逐级梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片。采用Olympus显微镜采集图像。

3.4油红O染色 冻存的肾组织标本在冰冻切片机上切成8 μm厚的切片，钙-甲醛固定液中充分固定20 min后，用提前配置好的油红O染液进行染色，时间为15 min，然后将切片倾斜，用50%的乙醇分化液轻轻冲洗切片进行分化，随后蒸馏水洗，苏木素染色染核3～5 min，甘油明胶进行封片。

3.5透射电镜观察 用预冷的2.5%戊二醛固定小鼠肾皮质，组织块大约1 mm×1 mm×1 mm 大小。随后将肾组织依次进行脱水、包埋和固化，将组织连续切片，应用乙酸双氧铀和枸橼酸铅进行染色，在Hitachi H7500 透射电镜下观察每10 个同等放大倍数视野下肾小管上皮细胞内脂滴数。

3.6肾组织甘油三酯及胆固醇含量的检测 各组小鼠肾组织标本各取100 mg制备组织匀浆；将氯仿与甲醇按照1 ∶1的比例混合好，取0.8 mL加入组织匀浆液中并充分混匀，室温下静置1 h，低温离心机内12 000 r/min离心10 min。将下层的脂质小心抽取出并于4 ℃冰箱保存。按照试剂盒的操作步骤分别测定肾组织内的胆固醇或甘油三酯含量。

3.7Western blot检测各组小鼠肾组织蛋白质的表达 各组小鼠肾组织标本充分裂解提取组织蛋白。应用BCA法测定各组蛋白质的浓度，取裂解好的组织蛋白50 μg，经SDS-PAGE后将蛋白转印至PVDF膜上；TBST缓冲液稍洗，将PVDF膜放于5%脱脂奶粉(TBST配制)中37 ℃封闭2 h，分别加入抗NLRP3、SCAP、SREBP-2、LDLR、HMGCR ABCA1、LXRα、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、p38 MAPK、p-p38 MAPK和β-actin抗体，4 ℃冰箱过夜。用TBST缓冲液稀释(5 000 ∶1)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 II 抗，37 ℃下孵育1.5 h；将ECL发光液均匀滴在PVDF膜上反应1 min，在Odyssey FC成像系统中显影。采用ImageJ软件进行结果统计。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠的生化指标及肾脏形态学改变的影响

与WT小鼠相比，糖尿病小鼠的FBG、BUN、SCr、TC及UAE均明显升高，NLRP3基因敲除降低了糖尿病小鼠高水平的BUN、Scr及UAE(P<0.05或P<0.01)，但对FBG及TC的水平没有影响，见图1。与此同时，NLRP3基因敲除改善了糖尿病小鼠的肾组织形态学变化，抑制了高糖导致的肾小球体积增大、系膜细胞增生及系膜基质的沉积，减轻了肾小管上皮细胞的空泡变性，见图2。

Figure 1. The changes of blood glucose, blood urea nitrogen, serum creatinine, triglyceride, total cholesterol and urine albumin excretion in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsWT+STZ group.
图1 各组小鼠生化指标的变化

Figure 2. Sections of HE staining in each group (×400).
图2 各组小鼠肾组织HE染色的观察

2 NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾脏NLRP3炎症小体及炎症反应的影响

糖尿病小鼠肾组织中NLRP3、ASC和caspase-1 p10的蛋白表达明显升高，同时NLRP3炎症小体下游效应分子cleaved IL-1β及IL-18的蛋白水平也显著增加；NLRP3基因敲除后上述蛋白的水平均显著下降(P<0.01)，见图3。

Figure 3. The effects ofNLRP3knockout on the protein levels of NLRP3, ASC, caspase-1 p10, cleaved IL-1β and IL-18 in the diabe-tic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
图3NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织NLRP3，ASC、caspase-1 p10、cleaved IL-1β和IL-18蛋白表达的影响

3 NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织脂质含量的影响

油红O染色及透射电镜结果显示，糖尿病小鼠肾小管细胞内脂滴大量沉积；而NLRP3基因敲除显著抑制了糖尿病小鼠肾小管细胞内的脂滴沉积，见图4A。同时，NLRP3基因敲除也显著缓解了糖尿病小鼠肾组织内的高水平甘油三酯和胆固醇含量(P<0.01)，见图4B、C。

Figure 4. The effects ofNLRP3knockout on lipid droplet formation (A) and content of triglyceride (B) and cholesterol (C) in diabetic mice. The lipid droplet formation in renal tissues was observed by electron microscopy (×15 000) and oil red O staining (scale bar=50 μm). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
图4NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织脂滴形成及脂质含量的影响

4 NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾脏胆固醇代谢的影响

与WT小鼠相比，糖尿病小鼠肾组织中参与胆固醇摄取和合成的SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的蛋白水平明显升高，而介导胆固醇流出的LXRα和ABCA1表达下调(P<0.01)；NLRP3基因敲除抑制了SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的高表达，同时上调了LXRα和ABCA1的表达(P<0.01)，见图5。

Figure 5. The effects ofNLRP3knockout on the protein expression of SCAP, SREBP-2, LDLR, HMGCR, ABCA1 and LXRα in diabetic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
图5NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织SCAP、SREBP-2、LDLR、HMGCR、ABCA1和LXRα 蛋白表达的影响

5 NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织p38 MAPK活化的影响

与WT小鼠相比，糖尿病小鼠肾组织中p38 MAPK的磷酸化水平升高；敲除NLRP3基因抑制了糖尿病小鼠肾组织p38 MAPK的磷酸化(P<0.01)，见图6。

Figure 6. The effects ofNLRP3knockout on phosphorylation of p38 MAPK in diabetic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
图6NLRP3基因敲除对糖尿病小鼠肾组织p38 MAPK磷酸化的影响

讨 论

DN发展至晚期的主要病理表现为肾小管及间质的持续进展性纤维化。研究发现，抑制或敲除NLRP3的表达能够显著抑制糖尿病小鼠的肾组织损伤及间质纤维化[5-6]。肾组织的无菌性炎症反应是造成DN间质纤维化的重要原因之一，抑制炎症反应可以有效缓解肾间质纤维化的进程。也有研究发现，SO2衍生物通过活化NLRP3炎症小体促进气道上皮细胞的炎症发生[7]。在本研究中，我们在敲除了NLRP3基因的小鼠体内发现，糖尿病状态下的肾组织炎症因子IL-1β和IL-18的表达显著下调，同时NLRP3炎症小体的组成成分ASC及caspase-1的表达也显著减少，提示NLRP3在糖尿病肾组织的炎症反应中可能发挥重要作用。

多种因素可以诱导NLRP3炎症小体活化，其中胆固醇是重要的诱导因素。细胞内沉积的胆固醇激活NLRP3炎症小体后并通过释放炎症因子IL-1β等加重组织或细胞的炎症反应[8]。据报道胆固醇同时也是疾病状态下NLRP3炎症小体活化后最主要的攻击目标，NLRP3的小分子抑制剂能够明显减少非酒精性脂肪肝小鼠肝脏总胆固醇、甘油三酯及游离脂肪酸的含量[9]。高脂饮食条件下，NLRP3-/-小鼠肾组织没有表现明显的胆固醇及磷脂的沉积[10]。本研究中，糖尿病小鼠模型肾组织内NLRP3蛋白表达异常增加，敲除NLRP3后小鼠的肾功能有所改善；同时肾小管细胞内的脂滴数明显减少，甘油三酯和胆固醇含量下降，但敲除NLRP3对糖尿病状态下小鼠血中总胆固醇的含量没有影响。以上研究提示NLRP3可能是通过改善肾组织自身的胆固醇代谢来参与糖尿病肾组织脂质沉积过程。我们前期研究发现：高糖能够导致体外培养的肾小管上皮细胞胆固醇蓄积，天然抗氧化剂花青素通过诱导ABCA1表达增加促进了胆固醇外流，从而抑制了高糖诱导的胆固醇沉积[11]。Guo等[12]证实NLRP3炎症小体的激活与胆固醇合成的主转录因子SREBP-2的成熟密切相关，活化的NLRP3进一步与胆固醇体内平衡的调节因子SCAP和SREBP2形成复合体，限制了巨噬细胞胆固醇的蓄积。在本研究中，我们发现高糖情况下LDLR、HMGCR、SCAP和SREBP-2在肾组织内的蛋白的表达显著增加；同样介导胆固醇流出的LXRα和ABCA1的表达下调。敲除NLRP3下调了肾组织SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的表达，上调了LXRα和ABCA1的表达。

p38 MAPK是重要的信号分子，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，参与调控多种细胞代谢过程。研究显示，利拉鲁肽改善了高同型半胱氨酸血症诱导的大鼠海马区域的炎症性损伤与其对p38 MAPK信号通路的抑制有关[13]。p38 MAPK信号通路的激活还参与了肝细胞的脂质沉积过程[14]。在本研究中，糖尿病小鼠肾组织的p38 MAPK磷酸化水平显著升高，敲除NLRP3后抑制了p38 MAPK的磷酸化；同时肾组织的炎症及脂质沉积都得到了显著改善，以上结果提示NLRP3介导的炎症反应在糖尿病肾损伤及脂代谢异常中发挥重要作用，这种作用可能是部分通过调控p38 MAPK信号通路活化实现的。

综上所述，NLRP3介导的炎症反应在糖尿病肾损伤及脂代谢异常中发挥重要作用，其中p38 MAPK信号通路的活化可能是NLRP3发挥作用的关键信号因子。NLRP3炎症小体有可能成为糖尿病肾组织损伤的防治靶点。