刘晓娟,王 静,张 娟,高月月,王 虹
(河北北方学院附属第一医院妇产科, 河北 张家口 075000)
宫颈癌是严重威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤。据报道,全球每年宫颈癌新发病例高达50万人,约有23万人死于宫颈癌[1]。近年来,宫颈癌患者的死亡率在一定程度上有所降低,但患者预后依然较差[2]。基因表达紊乱是肿瘤发生的根本原因[3],因此,从基因水平探讨宫颈癌的发病机制,可为该疾病的诊断和治疗提供新靶点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,参与细胞的生物学特性,调控肿瘤发生中的基因表达[4-5]。近年来发现Linc00152在多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤的发生、发展,如胃癌组织中Linc00152表达升高,下调Linc00152表达可抑制胃癌细胞的增殖和迁移[6]。Linc00152在结直肠癌细胞中表达升高,沉默Linc00152可抑制结直肠癌细胞的增殖并促进其凋亡[7]。然而,Linc00152在宫颈癌细胞中表达及分子机制的相关研究还很少见。lncRNA调控细胞增殖、凋亡、迁移等生物学过程的机制与其调控下游微小RNA(microRNAs,miRNAs,miR)的表达有关[8]。研究显示,miR-376c在宫颈癌组织和细胞中表达下调,上调miR-376c表达可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭[9]。生物信息学显示,Linc00152与miR-376c-3p存在结合位点,推测Linc00152能靶向调控miR-376c-3p表达。本研究主要探讨了Linc00152低表达或miR-376c-3p过表达对宫颈癌细胞生长、凋亡和放射敏感性的影响以及Linc00152与miR-376c-3p之间的调控关系,以期为宫颈癌的治疗提供新方向。
人宫颈癌细胞HeLa和SiHa以及正常宫颈细胞Ect1/E6E7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培养基购自HyClone;LipofectamineTM2000试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司;TRIzol试剂、反转录试剂盒和PCR试剂盒购自TaKaRa;引物序列由上海生共生物工程技术服务公司设计并合成;BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天公司;抗Bcl-2、Bax和GAPDH抗体购自Santa Cruz;HRP标记的 II 抗和萤光素酶检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司。
2.1细胞培养 复苏宫颈癌细胞HeLa和SiHa以及正常宫颈细胞Ect1/E6E7,加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于37 ℃、体积分数为5% CO2、湿度97%的培养箱中培养。细胞每2~3 d换1次液,融合至80%左右时,胰酶消化,用于后续试验或进行传代培养。
2.2RT-qPCR检测Linc00152和miR-376c-3p的表达 TRIzol试剂提取细胞中总RNA,具体操作参照RNA提取试剂盒操作说明书。NanoDrop分光光度计检测总RNA的浓度和纯度,A260/A280比值在1.8~2.0之间时,采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,-20 ℃保存备用。以cDNA为模板,进行PCR扩增:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,共进行40个循环。Linc00152的上游引物序列为5′-ACAAGCGGTGCCTGAGCC-3′,下游引物序列为5′-CCGACTCTCCTACACATCCACAG-3′;miR-376c-3p的上游引物序列为5′-AACATAGAGGAAATTCCACG-3′,下游引物序列为5′-TGCGCAAGCTCTGACGCGCT-3′;GAPDH的上游引物序列为5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′,下游引物序列为5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′;U6的上游引物序列为5′-CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3′,下游引物序列为5′-CCGATGCACGTGCTGTCGTCAACG-3′。Linc00152以GAPDH为内参照,miR-376c-3p以U6为内参照, 采用2-ΔΔCt法计算Linc00152和miR-376c-3p的相对表达水平。每个样品重复3次。
2.3细胞转染 取约5×105个对数生长期的HeLa细胞,接种在6 cm培养皿中,培养24 h。采用LipofectamineTM2000将si-NC、si-Linc00152-1和si-Linc00152-2分别转染至HeLa细胞,标记为si-NC组、si-Linc00152-1组和si-Linc00152-2组;将pcDNA3.1 和pcDNA3.1-Linc00152分别转染至HeLa细胞,标记为pcDNA3.1组和pcDNA3.1-Linc00152组;将miR-NC和miR-376c-3p mimics分别转染至HeLa细胞,标记为miR-NC组和miR-376c-3p组。以不转染的细胞作为空白对照组。转染6 h后,更换新鲜培养基,转染48 h后收集各组细胞,用于后续实验。
2.4MTT法检测细胞活力 调整细胞浓度为2.5×107/L,每孔200 μL,接种于96孔板中,于培养箱中培养。分别培养24 h、48 h和72 h后,MTT法检测490 nm处的A值。
2.5流式细胞术检测细胞凋亡 采用annexin V-FITC/PI双染法检测HeLa细胞凋亡。取各组处理后的细胞,PBS清洗后,加入500 μL Binding Buffer重悬细胞,加入5 μL annexin V-FITC,混合均匀。再加入5 μL PI,混合均匀,室温条件避光孵育10 min,流式细胞术检测HeLa细胞凋亡的百分比。实验重复3次。
2.6Western blot检测蛋白表达 取各组处理后的细胞,加入RIPA蛋白裂解液,置于冰上充分裂解。12 000 r/min、4 ℃离心10 min,收集上清液,BCA法测定蛋白含量。10% SDS-PAGE分离蛋白,分离后,电转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h。TBST洗膜后,分别加入抗cyclinD、P21、Bcl-2和Bax抗体,4 ℃摇床孵育12 h。TBST洗膜后,加入HRP标记的 II 抗,室温孵育1 h。TBST再次洗膜后,加入ECL发光液显影,凝胶成像系统拍照,ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。
2.7集落形成实验检测细胞的放射敏感性 取含200~1 000个HeLa的细胞悬液,等密度梯度接种于6孔板中,分别用0、2、4、6和8 Gy剂量的放射线照射细胞,源靶距15 cm,单次照射。照射后,细胞继续。待细胞出现集落后,吸弃培养基,加入甲醛固定10 min,结晶紫染色20 min,显微镜观察并计算细胞数超过50个的细胞集落。依据单击多靶模型,使用GraphPad Prism 5.0软件绘制细胞存活曲线。
2.8双萤光素酶报告基因实验 对数生长期的HeLa细胞接种于24孔板中,细胞融合至60%时,更换无血清培养基,采用采用LipofectamineTM2000分别共转染WT-Linc00152、MUT-Linc00152与miR-NC或miR-376c-3p mimics。每组设置3个复孔。转染6 h后,更换新鲜培养基,转染48 h后,按照双萤光素酶报告基因实验试剂盒操作说明书,检测萤光素酶活性。
采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。以均数±标准差(mean±SD)表示计量资料,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
RT-qPCR检测宫颈癌细胞HeLa和SiHa及正常宫颈细胞Ect1/E6E7中Linc00152及miR-376c-3p的表达水平,结果显示与Ect1/E6E7细胞比,HeLa和SiHa细胞中的Linc00152水平均明显升高(P<0.05),miR-376c-3p水平均明显降低(P<0.05),见图1,说明宫颈癌细胞中Linc00152表达上调,miR-376c-3p表达下调。由于HeLa细胞的Linc00152和miR-376c-3p表达比SiHa细胞变化大,因此,后续选择HeLa细胞用于生物学特性研究。
Figure 1. The expression levels of Linc00152 and miR-376c-3p in the cervical cancer cells were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsEct1/E6E7 group.
图1 Linc00152和miR-376c-3p在宫颈癌细胞系中表达水平的比较
RT-qPCR检测结果显示,与si-NC组比,si-Linc00152-1组和si-Linc00152-2组HeLa细胞的Linc00152水平明显降低(P<0.05),并且si-Linc00152-1组的Linc00152水平低于si-Linc00152-2组,因而后续选择转染si-Linc00152-1抑制HeLa细胞中Linc00152表达,见图2A。MTT结果显示,si-Linc00152组的HeLa细胞分别培养24 h、48 h和72 h,其A值低于si-NC组,说明抑制Linc00152表达可降低HeLa细胞的活力,见图2B。流式细胞术检测结果显示,si-Linc00152组的HeLa细胞凋亡率明显高于si-NC组(P<0.05),说明抑制Linc00152表达可促进HeLa细胞凋亡,见图2C。Western blot结果显示,与si-NC组比,si-Linc00152组HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2蛋白水平明显降低,P21和Bax蛋白水平明显升高(P<0.05),说明抑制Linc00152表达可影响细胞周期和凋亡相关蛋白的表达,见图2D。
生存分数曲线显示,随着放射线照射剂量的增加,HeLa细胞的生存分数降低。相同剂量放射线照射时,si-Linc00152组细胞生存分数显著低于si-NC组(P<0.05),说明抑制Linc00152表达可增强HeLa细胞的放射敏感性,见图3。
Figure 2. The effect ofLinc00152expression knock-down on the viability and apoptosis of HeLa cells. A: the expression of Linc00152 in the HeLa cells after transfected with si-Linc00152; B: the effect ofLinc00152expression knock-down on the viability of HeLa cells detected by MTT assay; C: the effect ofLinc00152expression knock-down on the apoptosis of HeLa cells; D: the effect ofLinc00152expression knock-down on the expression of cell cycle- and apoptosis-related proteins in the HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group.
图2 敲减Linc00152的表达对HeLa细胞活力和凋亡的影响
Figure 3. The effect ofLinc00152expression knock-down on survival fraction of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group.
图3 敲减Linc00152的表达对HeLa细胞存活分数的影响
生物信息学检索靶基因显示,Linc00152与miR-376c-3p存在可结合位点,见图4A。双萤光素酶报告基因实验结果显示,对HeLa细胞中共转染WT-Linc00152与miR-376c-3p mimics 的萤光素酶活性显著低于共转染WT-Linc00152与miR-NC的萤光素酶活性,而共转染MUT-Linc00152与miR-376c-3p和共转染MUT-Linc00152与miR-NC的萤光素酶活性差异无统计学显著性,说明Linc00152靶向调控miR-376c-3p的表达,见图4B。将pcDNA3.1和pcDNA3.1-Linc00152分别转染至HeLa细胞,RT-qPCR检测结果显示pcDNA3.1-Linc00152组HeLa细胞中miR-376c-3p的表达水平显著低于pcDNA3.1组(P<0.05),进一步说明HeLa细胞中Linc00152 对miR-376c-3p的表达存在负调控效应,见图4C。
Figure 4. Linc00152 targeted and regulated miR-376c-3p expression. A: Linc00152 has a binding site in the nucleotide sequence for miR-376c-3p; B: dual-luciferase reporter assay; C: the expression levels of miR-376c-3p in the HeLa cells after Linc00152 up-regulation or down-regulation. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group;&P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vssi-NC group.
图4 Linc00152靶向调控miR-376c-3p表达
将miR-NC和miR-376c-3p mimics分别转染至HeLa细胞, RT-qPCR结果显示,miR-376c-3p组的HeLa细胞中miR-376c-3p的表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05),说明转染成功,见图5A。MTT实验结果显示,miR-376c-3p组HeLa细胞的活力显著低于miR-NC组(P<0.05),见图5B。流式细胞术分析结果显示,miR-376c-3p组HeLa细胞的凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05),说明过表达miR-376c-3p能够促进HeLa细胞凋亡,见图5C。Western blot结果显示,与miR-NC组比,miR-376c-3p组的HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2的蛋白水平显著降低,P21和Bax的蛋白水平显著升高(P<0.05),说明过表达miR-376c-3p可能通过调节细胞周期和凋亡相关蛋白表达而影响HeLa细胞的生长和凋亡,见图5D。生存分数曲线显示,miR-376c-3p组的细胞生存分数显著低于miR-NC组比,说明过表达miR-376c-3p可增强HeLa细胞的放射敏感性,见图5E。
将si-Linc00152转染至HeLa细胞后,再分别转染anti-miR-NC和anti-miR-376c-3p,RT-qPCR结果显示,si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞中miR-376c-3p表达水平显著低于si-Linc00152+anti-miR-NC组(P<0.05),见图6A。MTT实验结果显示,si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞活力高于si-Linc00152+si-miR-NC组,且培养时间越长,差异越大,说明敲减miR-376c-3p表达能逆转Linc00152表达抑制对HeLa细胞活力的抑制作用,见图6B。流式细胞术分析结果显示,si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞凋亡率显著低于si-Linc00152+anti-miR-NC组,说明敲减miR-376c-3p表达能降低Linc00152低表达对HeLa细胞凋亡的促进作用,见图6C。Western blot实验结果显示,与si-Linc00152+anti-miR-NC组比,si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2的蛋白水平显著降低,P21和Bax的蛋白水平显著升高,说明敲减miR-376c-3p表达也能降低Linc00152低表达对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响,见图6D。生存分数曲线显示,与si-Linc00152+anti-miR-NC组比,si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组HeLa细胞的生存分数显著升高(P<0.05),说明敲减miR-376c-3p表达能降低Linc00152低表达对HeLa细胞的放射增敏作用,见图6E。
Figure 5. The effect of miR-376c-3p over-expression on the viability, apoptosis and survival fraction of HeLa cells. A: miR-376c-3p expression level in the HeLa cells after transfected with miR-376c-3p mimics; B: the effect of miR-376c-3p over-expression on the viability of HeLa cells; C: the effect of miR-376c-3p over-expression on the apoptosis of HeLa cells; D: the effect of miR-376c-3p over-expression on the expression levels of cell cycle- and apoptosis-related proteins in HeLa cells; E: the effect of miR-376c-3p over-expression on the survival fraction of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group.
图5 过表达miR-376c-3p对HeLa细胞活力、凋亡和存活分数的影响
lncRNA不具有蛋白编码功能,但参与调控机体基因表达。研究显示,lncRNA的异常表达与疾病的发生和发展过程密切相关,尤其是肿瘤[10]。宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤,探索lncRNA在宫颈癌中的分子机制可能为该疾病的治疗提供潜在的策略。
Linc00152基因位于染色体2p11.2,由2个具有编码功能基因间的区域转录,长度为828个核苷酸。有报道称,敲减Linc00152表达可抑制HeLa细胞的有丝分裂,对其细胞周期进程至关重要[11]。本研究结果显示,宫颈癌细胞中Linc00152表达上调,转染si-Linc00152至HeLa细胞可减低其细胞活力,提高凋亡率,说明下调Linc00152的表达能有效抑制HeLa细胞的生长,并诱导其凋亡,提示Linc00152作为促癌基因在宫颈癌中发挥作用,是宫颈癌诊治和预后的潜在生物学标志物。相关研究也表明Linc00152具有相同的促癌基因作用。Feng等[12]研究表明,肺癌组织中Linc00152过表达,敲减Linc00152的表达可降低肺癌细胞的增殖能力以及集落形成。Cai等[13]研究表明,Linc00152在胆囊癌组织中高表达,且高表达的患者预后较差,LINC00152在体外可显著促进细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化进展。肿瘤细胞能够耐受细胞毒化疗和放射治疗,是肿瘤复发、转移以及治疗耐受的根本原因[14]。细胞增殖依赖于细胞周期,cyclin D和P21蛋白是细胞周期的关键调控蛋白[15]。研究显示下调Linc00152表达能抑制cyclin D蛋白、促进P21蛋白表达,下调Linc00152可能通过调节与细胞周期相关的蛋白表达抑制HeLa细胞增殖。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是与细胞凋亡关系密切的蛋白质[16]。本研究结果显示,下调Linc00152的表达可抑制Bcl-2表达,促进Bax表达。生存分数曲线显示,下调Linc00152表达后,HeLa细胞的生存分数降低,说明下调Linc00152可增强HeLa细胞对放射线的敏感性。下调Linc00152抑制HeLa细胞生长、促进其凋亡以及增强放射敏感性的机制还需要进一步研究。
Figure 6. Knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the viability, apoptosis and survival fraction of HeLa cells. A: the expression levels of miR-376c-3p; B: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the viability of HeLa cells; C: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibitng Linc00152 on the apoptosis of HeLa cells; D: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the protein levels of cell cycle- and apoptosis-related molecules; E: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the survival fractions of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group;&P<0.05vssi-Linc00152+anti-miR-NC group.
图6 敲减miR-376c-3p表达能逆转抑制Linc00152对HeLa细胞活力、凋亡和存活分数的影响作用
LncRNAs在转录、转录后、表观遗传等多个层面调控基因表达。研究显示,Linc00152在胶质瘤组织和神经胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)中表达上调,敲除Linc00152可抑制细胞凋亡增殖,迁移和侵袭,同时促进GSC凋亡,Linc00152通过与miR-103a-3p竞争性结合调节GSC细胞的恶性行为[17]。Linc00152在肝细胞癌组织中表达升高,敲减Linc00152可抑制体内肿瘤的发生,其通过结合miR-193a/b-3p调节靶基因CCND1而影响癌细胞的增殖[18]。为了分析Linc00152在宫颈癌中的潜在致癌机制,我们用生物信息学分析软件预测发现miR-376c-3p可作为Linc00152的新靶标,miR-376c-3p在宫颈癌细胞中表达下调,过表达miR-376c-3p可抑制HeLa细胞的生长,促进其凋亡,并能增强HeLa细胞的放射敏感性,提示miR-376c-3p作为抑癌基因参与宫颈癌的发生和发展。这与miR-376c-3p在人口腔鳞癌[19]和胃肠道间质瘤[20]中发挥抑癌作用的报道结果一致。双萤光素酶报告基因实验结果显示,Linc00152在HeLa细胞中靶向调控miR-376c-3p。转染pcDNA3.1-Linc00152的HeLa细胞中miR-376c-3p表达水平降低,进一步说明了HeLa细胞中Linc00152负调控miR-376c-3p的表达。此外,研究还显示,抑制miR-376c-3p表达可降低抑制si-Linc00152对HeLa细胞的活力、凋亡以及放射敏感性的影响。这些结果均表明,Linc00152通过负调控miR-376c-3p表达在HeLa细胞的生长、凋亡以及放射敏感性中发挥重要作用。
综上所述,Linc00152在宫颈癌细胞中高表达;下调Linc00152表达可抑制细胞的生长,诱导其凋亡,并增强细胞的放射敏感性,机制与其负向调控miR-376c-3p有关。