Linc00152靶向miR-376c-3p对宫颈癌细胞活力、凋亡和放射敏感性的影响*

刘晓娟，王 静，张 娟，高月月，王 虹

(河北北方学院附属第一医院妇产科， 河北 张家口 075000)

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤。据报道，全球每年宫颈癌新发病例高达50万人，约有23万人死于宫颈癌[1]。近年来，宫颈癌患者的死亡率在一定程度上有所降低，但患者预后依然较差[2]。基因表达紊乱是肿瘤发生的根本原因[3]，因此，从基因水平探讨宫颈癌的发病机制，可为该疾病的诊断和治疗提供新靶点。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，参与细胞的生物学特性，调控肿瘤发生中的基因表达[4-5]。近年来发现Linc00152在多种肿瘤中表达异常，参与肿瘤的发生、发展，如胃癌组织中Linc00152表达升高，下调Linc00152表达可抑制胃癌细胞的增殖和迁移[6]。Linc00152在结直肠癌细胞中表达升高，沉默Linc00152可抑制结直肠癌细胞的增殖并促进其凋亡[7]。然而，Linc00152在宫颈癌细胞中表达及分子机制的相关研究还很少见。lncRNA调控细胞增殖、凋亡、迁移等生物学过程的机制与其调控下游微小RNA(microRNAs，miRNAs，miR)的表达有关[8]。研究显示，miR-376c在宫颈癌组织和细胞中表达下调，上调miR-376c表达可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭[9]。生物信息学显示，Linc00152与miR-376c-3p存在结合位点，推测Linc00152能靶向调控miR-376c-3p表达。本研究主要探讨了Linc00152低表达或miR-376c-3p过表达对宫颈癌细胞生长、凋亡和放射敏感性的影响以及Linc00152与miR-376c-3p之间的调控关系，以期为宫颈癌的治疗提供新方向。

材 料 和 方 法

1 细胞和实验试剂

人宫颈癌细胞HeLa和SiHa以及正常宫颈细胞Ect1/E6E7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培养基购自HyClone；LipofectamineTM2000试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒和PCR试剂盒购自TaKaRa；引物序列由上海生共生物工程技术服务公司设计并合成；BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天公司；抗Bcl-2、Bax和GAPDH抗体购自Santa Cruz；HRP标记的 II 抗和萤光素酶检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司。

2 实验方法

2.1细胞培养 复苏宫颈癌细胞HeLa和SiHa以及正常宫颈细胞Ect1/E6E7，加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO2、湿度97%的培养箱中培养。细胞每2～3 d换1次液，融合至80%左右时，胰酶消化，用于后续试验或进行传代培养。

2.2RT-qPCR检测Linc00152和miR-376c-3p的表达 TRIzol试剂提取细胞中总RNA，具体操作参照RNA提取试剂盒操作说明书。NanoDrop分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，A260/A280比值在1.8～2.0之间时，采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。以cDNA为模板，进行PCR扩增:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环。Linc00152的上游引物序列为5′-ACAAGCGGTGCCTGAGCC-3′，下游引物序列为5′-CCGACTCTCCTACACATCCACAG-3′；miR-376c-3p的上游引物序列为5′-AACATAGAGGAAATTCCACG-3′，下游引物序列为5′-TGCGCAAGCTCTGACGCGCT-3′；GAPDH的上游引物序列为5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物序列为5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；U6的上游引物序列为5′-CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3′，下游引物序列为5′-CCGATGCACGTGCTGTCGTCAACG-3′。Linc00152以GAPDH为内参照，miR-376c-3p以U6为内参照， 采用2-ΔΔCt法计算Linc00152和miR-376c-3p的相对表达水平。每个样品重复3次。

2.3细胞转染 取约5×105个对数生长期的HeLa细胞，接种在6 cm培养皿中，培养24 h。采用LipofectamineTM2000将si-NC、si-Linc00152-1和si-Linc00152-2分别转染至HeLa细胞，标记为si-NC组、si-Linc00152-1组和si-Linc00152-2组；将pcDNA3.1 和pcDNA3.1-Linc00152分别转染至HeLa细胞，标记为pcDNA3.1组和pcDNA3.1-Linc00152组；将miR-NC和miR-376c-3p mimics分别转染至HeLa细胞，标记为miR-NC组和miR-376c-3p组。以不转染的细胞作为空白对照组。转染6 h后，更换新鲜培养基，转染48 h后收集各组细胞，用于后续实验。

2.4MTT法检测细胞活力 调整细胞浓度为2.5×107/L，每孔200 μL，接种于96孔板中，于培养箱中培养。分别培养24 h、48 h和72 h后，MTT法检测490 nm处的A值。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 采用annexin V-FITC/PI双染法检测HeLa细胞凋亡。取各组处理后的细胞，PBS清洗后，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL annexin V-FITC，混合均匀。再加入5 μL PI，混合均匀，室温条件避光孵育10 min，流式细胞术检测HeLa细胞凋亡的百分比。实验重复3次。

2.6Western blot检测蛋白表达 取各组处理后的细胞，加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上充分裂解。12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白含量。10% SDS-PAGE分离蛋白，分离后，电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。TBST洗膜后，分别加入抗cyclinD、P21、Bcl-2和Bax抗体，4 ℃摇床孵育12 h。TBST洗膜后，加入HRP标记的 II 抗，室温孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入ECL发光液显影，凝胶成像系统拍照，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

2.7集落形成实验检测细胞的放射敏感性 取含200～1 000个HeLa的细胞悬液，等密度梯度接种于6孔板中，分别用0、2、4、6和8 Gy剂量的放射线照射细胞，源靶距15 cm，单次照射。照射后，细胞继续。待细胞出现集落后，吸弃培养基，加入甲醛固定10 min，结晶紫染色20 min，显微镜观察并计算细胞数超过50个的细胞集落。依据单击多靶模型，使用GraphPad Prism 5.0软件绘制细胞存活曲线。

2.8双萤光素酶报告基因实验 对数生长期的HeLa细胞接种于24孔板中，细胞融合至60%时，更换无血清培养基，采用采用LipofectamineTM2000分别共转染WT-Linc00152、MUT-Linc00152与miR-NC或miR-376c-3p mimics。每组设置3个复孔。转染6 h后，更换新鲜培养基，转染48 h后，按照双萤光素酶报告基因实验试剂盒操作说明书，检测萤光素酶活性。

3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。以均数±标准差(mean±SD)表示计量资料，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 Linc00152和miR-376c-3p在宫颈癌细胞系中的表达水平

RT-qPCR检测宫颈癌细胞HeLa和SiHa及正常宫颈细胞Ect1/E6E7中Linc00152及miR-376c-3p的表达水平，结果显示与Ect1/E6E7细胞比，HeLa和SiHa细胞中的Linc00152水平均明显升高(P<0.05)，miR-376c-3p水平均明显降低(P<0.05)，见图1，说明宫颈癌细胞中Linc00152表达上调，miR-376c-3p表达下调。由于HeLa细胞的Linc00152和miR-376c-3p表达比SiHa细胞变化大，因此，后续选择HeLa细胞用于生物学特性研究。

Figure 1. The expression levels of Linc00152 and miR-376c-3p in the cervical cancer cells were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsEct1/E6E7 group.
图1 Linc00152和miR-376c-3p在宫颈癌细胞系中表达水平的比较

2 敲减Linc00152的表达对宫颈癌HeLa细胞活力和凋亡的影响

RT-qPCR检测结果显示，与si-NC组比，si-Linc00152-1组和si-Linc00152-2组HeLa细胞的Linc00152水平明显降低(P<0.05)，并且si-Linc00152-1组的Linc00152水平低于si-Linc00152-2组，因而后续选择转染si-Linc00152-1抑制HeLa细胞中Linc00152表达，见图2A。MTT结果显示，si-Linc00152组的HeLa细胞分别培养24 h、48 h和72 h，其A值低于si-NC组，说明抑制Linc00152表达可降低HeLa细胞的活力，见图2B。流式细胞术检测结果显示，si-Linc00152组的HeLa细胞凋亡率明显高于si-NC组(P<0.05)，说明抑制Linc00152表达可促进HeLa细胞凋亡，见图2C。Western blot结果显示，与si-NC组比，si-Linc00152组HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2蛋白水平明显降低，P21和Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)，说明抑制Linc00152表达可影响细胞周期和凋亡相关蛋白的表达，见图2D。

3 敲减Linc00152的表达对HeLa细胞放射敏感性的影响

生存分数曲线显示，随着放射线照射剂量的增加，HeLa细胞的生存分数降低。相同剂量放射线照射时，si-Linc00152组细胞生存分数显著低于si-NC组(P<0.05)，说明抑制Linc00152表达可增强HeLa细胞的放射敏感性，见图3。

Figure 2. The effect ofLinc00152expression knock-down on the viability and apoptosis of HeLa cells. A: the expression of Linc00152 in the HeLa cells after transfected with si-Linc00152; B: the effect ofLinc00152expression knock-down on the viability of HeLa cells detected by MTT assay; C: the effect ofLinc00152expression knock-down on the apoptosis of HeLa cells; D: the effect ofLinc00152expression knock-down on the expression of cell cycle- and apoptosis-related proteins in the HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group.
图2 敲减Linc00152的表达对HeLa细胞活力和凋亡的影响

Figure 3. The effect ofLinc00152expression knock-down on survival fraction of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group.
图3 敲减Linc00152的表达对HeLa细胞存活分数的影响

4 Linc00152靶向调控miR-376c-3p的表达

生物信息学检索靶基因显示，Linc00152与miR-376c-3p存在可结合位点，见图4A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，对HeLa细胞中共转染WT-Linc00152与miR-376c-3p mimics 的萤光素酶活性显著低于共转染WT-Linc00152与miR-NC的萤光素酶活性，而共转染MUT-Linc00152与miR-376c-3p和共转染MUT-Linc00152与miR-NC的萤光素酶活性差异无统计学显著性，说明Linc00152靶向调控miR-376c-3p的表达，见图4B。将pcDNA3.1和pcDNA3.1-Linc00152分别转染至HeLa细胞，RT-qPCR检测结果显示pcDNA3.1-Linc00152组HeLa细胞中miR-376c-3p的表达水平显著低于pcDNA3.1组(P<0.05)，进一步说明HeLa细胞中Linc00152 对miR-376c-3p的表达存在负调控效应，见图4C。

Figure 4. Linc00152 targeted and regulated miR-376c-3p expression. A: Linc00152 has a binding site in the nucleotide sequence for miR-376c-3p; B: dual-luciferase reporter assay; C: the expression levels of miR-376c-3p in the HeLa cells after Linc00152 up-regulation or down-regulation. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group;&P<0.05vspcDNA3.1 group;#P<0.05vssi-NC group.
图4 Linc00152靶向调控miR-376c-3p表达

5 过表达miR-376c-3p对宫颈癌HeLa细胞的活力、凋亡和放射敏感性的影响

将miR-NC和miR-376c-3p mimics分别转染至HeLa细胞， RT-qPCR结果显示，miR-376c-3p组的HeLa细胞中miR-376c-3p的表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05)，说明转染成功，见图5A。MTT实验结果显示，miR-376c-3p组HeLa细胞的活力显著低于miR-NC组(P<0.05),见图5B。流式细胞术分析结果显示，miR-376c-3p组HeLa细胞的凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05)，说明过表达miR-376c-3p能够促进HeLa细胞凋亡，见图5C。Western blot结果显示，与miR-NC组比，miR-376c-3p组的HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2的蛋白水平显著降低，P21和Bax的蛋白水平显著升高(P<0.05)，说明过表达miR-376c-3p可能通过调节细胞周期和凋亡相关蛋白表达而影响HeLa细胞的生长和凋亡,见图5D。生存分数曲线显示，miR-376c-3p组的细胞生存分数显著低于miR-NC组比，说明过表达miR-376c-3p可增强HeLa细胞的放射敏感性，见图5E。

6 敲减miR-376c-3p表达能逆转Linc00152表达抑制对HeLa细胞活力、凋亡和放射敏感性的作用

将si-Linc00152转染至HeLa细胞后，再分别转染anti-miR-NC和anti-miR-376c-3p，RT-qPCR结果显示，si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞中miR-376c-3p表达水平显著低于si-Linc00152+anti-miR-NC组(P<0.05),见图6A。MTT实验结果显示，si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞活力高于si-Linc00152+si-miR-NC组，且培养时间越长，差异越大，说明敲减miR-376c-3p表达能逆转Linc00152表达抑制对HeLa细胞活力的抑制作用，见图6B。流式细胞术分析结果显示，si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组的HeLa细胞凋亡率显著低于si-Linc00152+anti-miR-NC组，说明敲减miR-376c-3p表达能降低Linc00152低表达对HeLa细胞凋亡的促进作用，见图6C。Western blot实验结果显示，与si-Linc00152+anti-miR-NC组比，si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组HeLa细胞中cyclin D和Bcl-2的蛋白水平显著降低，P21和Bax的蛋白水平显著升高，说明敲减miR-376c-3p表达也能降低Linc00152低表达对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响，见图6D。生存分数曲线显示，与si-Linc00152+anti-miR-NC组比，si-Linc00152+anti-miR-376c-3p组HeLa细胞的生存分数显著升高(P<0.05)，说明敲减miR-376c-3p表达能降低Linc00152低表达对HeLa细胞的放射增敏作用，见图6E。

Figure 5. The effect of miR-376c-3p over-expression on the viability, apoptosis and survival fraction of HeLa cells. A: miR-376c-3p expression level in the HeLa cells after transfected with miR-376c-3p mimics; B: the effect of miR-376c-3p over-expression on the viability of HeLa cells; C: the effect of miR-376c-3p over-expression on the apoptosis of HeLa cells; D: the effect of miR-376c-3p over-expression on the expression levels of cell cycle- and apoptosis-related proteins in HeLa cells; E: the effect of miR-376c-3p over-expression on the survival fraction of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group.
图5 过表达miR-376c-3p对HeLa细胞活力、凋亡和存活分数的影响

讨 论

lncRNA不具有蛋白编码功能，但参与调控机体基因表达。研究显示，lncRNA的异常表达与疾病的发生和发展过程密切相关，尤其是肿瘤[10]。宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，探索lncRNA在宫颈癌中的分子机制可能为该疾病的治疗提供潜在的策略。

Linc00152基因位于染色体2p11.2，由2个具有编码功能基因间的区域转录，长度为828个核苷酸。有报道称，敲减Linc00152表达可抑制HeLa细胞的有丝分裂，对其细胞周期进程至关重要[11]。本研究结果显示，宫颈癌细胞中Linc00152表达上调，转染si-Linc00152至HeLa细胞可减低其细胞活力，提高凋亡率，说明下调Linc00152的表达能有效抑制HeLa细胞的生长，并诱导其凋亡，提示Linc00152作为促癌基因在宫颈癌中发挥作用，是宫颈癌诊治和预后的潜在生物学标志物。相关研究也表明Linc00152具有相同的促癌基因作用。Feng等[12]研究表明，肺癌组织中Linc00152过表达，敲减Linc00152的表达可降低肺癌细胞的增殖能力以及集落形成。Cai等[13]研究表明，Linc00152在胆囊癌组织中高表达，且高表达的患者预后较差，LINC00152在体外可显著促进细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化进展。肿瘤细胞能够耐受细胞毒化疗和放射治疗，是肿瘤复发、转移以及治疗耐受的根本原因[14]。细胞增殖依赖于细胞周期，cyclin D和P21蛋白是细胞周期的关键调控蛋白[15]。研究显示下调Linc00152表达能抑制cyclin D蛋白、促进P21蛋白表达，下调Linc00152可能通过调节与细胞周期相关的蛋白表达抑制HeLa细胞增殖。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是与细胞凋亡关系密切的蛋白质[16]。本研究结果显示，下调Linc00152的表达可抑制Bcl-2表达，促进Bax表达。生存分数曲线显示，下调Linc00152表达后，HeLa细胞的生存分数降低，说明下调Linc00152可增强HeLa细胞对放射线的敏感性。下调Linc00152抑制HeLa细胞生长、促进其凋亡以及增强放射敏感性的机制还需要进一步研究。

Figure 6. Knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the viability, apoptosis and survival fraction of HeLa cells. A: the expression levels of miR-376c-3p; B: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the viability of HeLa cells; C: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibitng Linc00152 on the apoptosis of HeLa cells; D: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the protein levels of cell cycle- and apoptosis-related molecules; E: knock-down ofmiR-376c-3pexpression reversed the effect of inhibiting Linc00152 on the survival fractions of HeLa cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-NC group;&P<0.05vssi-Linc00152+anti-miR-NC group.
图6 敲减miR-376c-3p表达能逆转抑制Linc00152对HeLa细胞活力、凋亡和存活分数的影响作用

LncRNAs在转录、转录后、表观遗传等多个层面调控基因表达。研究显示，Linc00152在胶质瘤组织和神经胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)中表达上调，敲除Linc00152可抑制细胞凋亡增殖，迁移和侵袭，同时促进GSC凋亡，Linc00152通过与miR-103a-3p竞争性结合调节GSC细胞的恶性行为[17]。Linc00152在肝细胞癌组织中表达升高，敲减Linc00152可抑制体内肿瘤的发生，其通过结合miR-193a/b-3p调节靶基因CCND1而影响癌细胞的增殖[18]。为了分析Linc00152在宫颈癌中的潜在致癌机制，我们用生物信息学分析软件预测发现miR-376c-3p可作为Linc00152的新靶标，miR-376c-3p在宫颈癌细胞中表达下调，过表达miR-376c-3p可抑制HeLa细胞的生长，促进其凋亡，并能增强HeLa细胞的放射敏感性，提示miR-376c-3p作为抑癌基因参与宫颈癌的发生和发展。这与miR-376c-3p在人口腔鳞癌[19]和胃肠道间质瘤[20]中发挥抑癌作用的报道结果一致。双萤光素酶报告基因实验结果显示，Linc00152在HeLa细胞中靶向调控miR-376c-3p。转染pcDNA3.1-Linc00152的HeLa细胞中miR-376c-3p表达水平降低，进一步说明了HeLa细胞中Linc00152负调控miR-376c-3p的表达。此外，研究还显示，抑制miR-376c-3p表达可降低抑制si-Linc00152对HeLa细胞的活力、凋亡以及放射敏感性的影响。这些结果均表明，Linc00152通过负调控miR-376c-3p表达在HeLa细胞的生长、凋亡以及放射敏感性中发挥重要作用。

综上所述，Linc00152在宫颈癌细胞中高表达；下调Linc00152表达可抑制细胞的生长，诱导其凋亡，并增强细胞的放射敏感性，机制与其负向调控miR-376c-3p有关。