结肠癌化疗耐药相关miRNA表达谱的初步研究*

陈 敏，张锦松，徐 霖，陈两洲，宋 学

(北京中医药大学厦门医院普外科， 福建 厦门 361009)

随着人们生活水平提高、生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率在逐年上升。目前其发病率在恶性肿瘤中已上升至第3位[1]。在中国，结直肠癌发病率已经从70年代的12/千万上升到56/千万，年平均增长率为4.2%，显著高于国际水平[2]。结直肠癌最有效的治疗方法是根治性手术。但有些患者在手术前就已出现肿瘤远处转移或者在根治性手术之后出现肿瘤复发。对于这些患者，化疗可以抑制肿瘤进一步生长，从而延长患者生存时间。然而，化疗耐药仍是横亘于前的难题。有些类型的肿瘤细胞天生对某些化疗药耐药，而且绝大多数癌细胞在化疗过程中会逐渐形成化疗耐药，从而影响化疗疗效。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是内源性的非编码RNA，大小约20～25个核苷酸，通过结合在靶基因的3′末端来降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译。miRNAs参与细胞增殖、分化、血管生成和凋亡等多种生物过程，其调节失衡与多种疾病有关，包括结直肠癌。异常的miRNAs表达与结直肠癌的发病和进展密切相关[3]。在结直肠癌发生和发展过程中, miRNAs可起到原癌基因或抑癌基因的作用。miRNAs与结直肠癌的化疗耐药也是息息相关。通过对miRNAs功能的识别，有望发现新的治疗方法来逆转化疗耐药。但是miRNAs在化疗耐药中的机制十分复杂。因此, 在整体上了解miRNAs调节肿瘤对化疗耐药的作用机制至关重要。应用基因芯片技术从整体上阐述miRNAs与结直肠癌化疗耐药相关性的文章较少，因此本研究利用基因芯片技术, 筛选人结肠癌细胞系及其耐长春新碱细胞系表达有明显差异的miRNAs，并用RT-qPCR技术验证结果；预测可能受其调控的基因，并对这些基因进行生物信息学分析；从整体上对miRNAs与结肠癌化疗耐药的关系进行了详细的阐述，为研究miRNAs在化疗耐药中的作用提供线索。

材 料 和 方 法

1 细胞株

人结肠癌细胞系HCT8及其耐长春新碱细胞系HCT8/v购自上海奥陆生物有限公司。

2 主要试剂

长春新碱(vincristine，VCR)和生理盐水购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MTT购自Sigma-Aldrich；PBS、DMEM培养基、0.25%胰酶和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Life Tech。所用的芯片为Agilent miRNA芯片，由上海康成生物技术有限公司提供技术支持。所用引物由上海康成生物技术有限公司根据设计合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR使用引物列表Table 1. The primer list using in RT-qPCR

F: forward; R: reverse; GSP: gene-specific primer.

3 主要方法

3.1细胞培养及耐药性检测 实验细胞于DMEM培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。MTT法验证细胞的耐药性。

3.2RNA的提取和质量控制 按照TRIzol方法抽提总RNA。应用NanoDrop 1000评估RNA完整性和质量。变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性及确定不存在污染。样品A260/A280的比率接近 2.0(1.8～2.1),A260/A230的比率大于1.8。电泳RNA的28S和18S条带光滑，亮度强。上条带的强度是下条带的2倍左右。在28S条带上方无弥散带或条出现。

3.3标记、杂交、清洗和扫描 采用Agilent的miRNA Complete Labeling and Hyb Kit进行标记。将500 ng的RNA添加到1.5 mL微离心管中。加入2 μL的CIP Master Mix，并在37 ℃下孵育反应30 min。样品中加入2.8 μL的DMSO,并在100 ℃下孵育5至10 min。立即转移到冰水浴。加入4.5 μL的Ligation Master Mix，并在16 ℃孵育2 h。使用带加热器的真空集中器加热到45～55 ℃，完全干燥样本。在18 μL无核酸酶水中重新悬浮干燥的样品。加入4.5 μL的10× Gene Expression Blocking Agent和2×Hi-RPM Hybridization Buffer。在100 ℃孵育5 min,并立即转移到冰浴5 min。将干净的垫片装入Agilent SureHyb室底座，标签朝上，与室底座的矩形部分对齐。垫片沾湿，并评估气泡的流动性。将组装的室置于设置为55 ℃的杂交炉中。杂交旋转器的转速设置为在20 r/min，在55 ℃下杂交20 h。随后按程序完成清洗，将片放在片支架中。芯片经过洗涤后，使用Agilent Microarray Scanner (Agilent p/n G2505C)扫描。

3.4芯片数据分析 使用Agilent Feature Extraction 11.0.1.1软件获得芯片图，并读值，得到原始数据。使用GeneSpring GX 14.9软件(Agilent Technologies)对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在6个样品中至少有3个被标记为detected)进行进一步分析。两组样品间具有统计学意义的差异表达miRNAs通过火山图筛选。两个样品间差异表达miRNAs通过Fold Change筛选。使用R脚本进行层次聚类。

3.5RT-qPCR验证 TRIzol法提取样品的总RNA并进行质量检测。检测合格后，使用RNA进行cDNA合成。合成的cDNA用于RT-qPCR。各样品的目的miRNA和内参照(U6)分别进行real-time PCR反应。数据采用2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表3。

3.6靶基因预测和生物信息学分析 选取部分有显著差异表达的miRNAs进行靶基因预测和生物信息学分析。应用TargetScan 7.1和miRDB 5进行靶基因预测，对2个数据库预测的基因取交集。利用GO和KEGG数据库对交集内的靶基因进行生物信息学分析。

结 果

1 HCT8/v对长春新碱耐药性的检测

各种浓度的长春新碱均对HCT8/v细胞无抑制作用，结果如图1所示。

Figure 1. The viability of HCT8/v cells treated with vincristine (VCR) at different concentrations. Mean±SD.n=3.
图1 HCT8/v细胞对长春新碱耐药性的测定

2 细胞中RNA纯化和质检

人结肠癌细胞系HCT8及其耐长春新碱细胞系HCT8/v的总RNA经NanoDrop 1000检测A260/A280的比率均介于1.8～2.1之间,A260/A230的比率均大于1.8。经琼脂糖凝胶电泳鉴定28S和18S两条带清晰，没有拖尾现象,提示RNA的质量合格。结果如图2所示。

Figure 2. Results of denatured agarose gel electrophoresis. C=HCT8; V=HCT8/v.
图2 变性琼脂糖凝胶电泳结果

3 芯片扫描结果

HCT8/v和HCT8细胞的miRNA经基因芯片检测比较, 改变2倍以上的miRNA数目为342个, 其中基因表达上调190个, 基因表达下调152个，见图3。部分差异表达的基因列表见表2、3。

Figure 3. Volcanic map of differentially expressed miRNAs between HCT8 group and HCT8/v group. Green dot represents a cut of ≥2 times; red dot represents an increase of ≥2 times; green horizontal line above representsP≤0.05, green horizontal line below representsP≥0.05.
图3 HCT8组和HCT8/v组间表达差异miRNAs的火山图

4 RT-qPCR验证芯片结果

挑选5个有显著差异表达的miRNAs进行RT-qPCR验证，其中miR-125-5p、miR-181c-5p和miR-153-3的表达情况和芯片检测结果一致，miR-130a-3p和miR-149-3p的表达与芯片检测结果不一致，见图4。

5 靶基因预测

对上述部分miRNAs的靶基因进行预测，TargetScan 7.1预测到4 150个靶基因，miRDB 5预测到3 311个靶基因，2个数据库共同预测到的基因有1 799个。

5 KEGG通路富集分析

KEGG分析结果显示，这些miRNAs的靶基因主要涉及94个信号通路:其中最为富集的是轴突导向(axon guidance)通路，有39个基因的表达发生变化；其次分别是胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)及磷脂酶D信号通路(phospholipase D signaling pathway)，分别有31及32个基因发生变化；其余变化显著的依次为肾细胞癌(renal cell carcinoma)、动物自噬(autophagy-animal)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、结直肠癌(colorectal cancer)、mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)。

6 GO通路富集分析

生物过程(biological processes，BP)分析结果显示，这些miRNAs的靶基因主要涉及1 446个生物学过程：其中最为富集的是正向调节细胞过程(positive regulation of cellular process)，有604个基因的表达发生变化；其次分别是正向调节生物过程(positive re-gulation of biological process)及正向调节代谢过程(positive regulation of metabolic process)，分别有654及415个基因发生变化；其余变化显著的依次为正向调节细胞代谢过程(positive regulation of cellular metabolic process)、神经系统发育(nervous system development)、正向调节大分子代谢过程(positive regulation of macromolecule metabolic process)、正向调节氮化合物代谢过程(positive regulation of nitrogen compound metabolic process)、负向调节细胞过程(negative regulation of cellular process)、正向调节基因表达(positive regulation of gene expression)和调节细胞代谢过程(regulation of cellular metabolic process)。

表2 下调≥2倍的miRNAs (部分)Table 2. The miRNAs down-regulated by ≥2 times (part)

表3 上调≥2倍的miRNAs (部分)Table 3. The miRNAs down-regulated by ≥2 times (part)

Figure 4. The results of RT-qPCR.
图4 RT-qPCR实验结果

细胞组分(cell component，CC)分析结果显示，这些miRNAs的靶基因主要涉及268个细胞组分：其中最为富集的是细胞内(intracellular)，有1 351个基因的表达发生变化；其次分别是细胞内部分(intracellular part)及细胞内细胞器(intracellular organelle),分别有1 331及1 184个基因发生变化；其余变化显著的依次为细胞器(organelle)、细胞质(cytoplasm)、膜旁细胞器(membrane-bound organelles)、细胞内有界细胞器(intracellular membrane-bound organelles )、神经元部分(neuron part)、细胞内细胞器部分(intracellular organelle part)和突触小泡(synaptic vesicle)。

分子功能(molecular function，MF)分析结果显示，这些miRNAs的靶基因主要涉及209个分子功能:其中最为富集的是蛋白结合(protein binding)，有1 120个基因的表达发生变化；其次分别是酶结合(enzyme binding)及结合(binding),分别有281及1 330个基因发生变化;其余变化显著的依次为调节区域核酸结合(regulatory region nucleic acid binding)、RNA聚合酶II调控区DNA结合(RNA polymerase II regulatory region DNA binding)、转录调控区DNA结合(transcription regulatory region DNA binding)、序列特异性双链DNA结合(sequence-specific double stranded DNA binding)、RNA聚合酶II调控区序列特异性DNA结合(RNA polymerase II regulatory region sequence-specific DNA binding)、转录调控区序列特异性DNA结合(transcription regulatory region sequence-specific DNA binding)、RNA聚合酶II转录因子活性及序列特异性DNA结合(RNA polymerase II transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)。

读者可向作者索取KEGG分析和GO分析的详细图则和相关资料。

讨 论

化疗耐药是导致化疗失败的主要原因。如何逆转化疗耐药是世界难题。miRNAs与肠癌细胞化疗耐药的关系十分密切[4-5]。对于肠癌化疗耐药，从miRNAs入手研究也许能开辟一条新的道路。

我们通过基因芯片和RT-qPCR首次证明miR-125-5p、miR-181c-5p和miR-153-3p与结肠癌化疗耐药相关，这些miRNAs在其他恶性肿瘤化疗耐药的过程中也起重要作用[6-7]，其调节结肠癌化疗耐药的机制有待进一步研究。

GO主要从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对基因进行分析。通过GO富集分析可以了解这些靶基因富集在哪些生物学功能上、哪些生化途径中、哪些细胞结构上。信号通路指的是多个蛋白质间相互作用来调节细胞的功能和代谢的过程。KEGG分析结果可见，靶基因最为富集的是轴突导向通路，有39个基因富集。轴突导向通路主要在重新排列生长锥和轴突的局部细胞骨架和质膜中发挥作用，其也可以通过局部翻译和转录来控制基因的表达，与细胞迁移相关[8]。有学者一次性研究并确定这条通路上的16个基因表达异常与胰腺癌相关[9]，而研究这条通路上单个基因表达异常与肿瘤关系的文章更是不胜枚举。从GO的有向无环图的结果来看，在分子功能方面其显著富集的最基本旁路是RNA聚合酶II调控区序列特异性DNA结合旁路，有98个基因富集。这条旁路的蛋白能有选择性地和非共价地和DNA的特定序列(一个调控区域，能通过RNA聚合酶II控制一个基因或顺反子转录)相互作用。在生物过程方面：其显著富集的最基本的过程是：(1)正向调节基因表达(positive regulation of gene expression)：即增加基因表达的频率、速率或程度的生物过程。基因表达是个过程，在这个过程里，基因的编码序列转化成一个成熟的基因产物(蛋白或RNA)。包括RNA转录子和成熟的RNA产物(mRNA或circRNA)生产过程，以及mRNA或circRNA转化成蛋白的过程。也包括蛋白的成熟过程(当需要从非活性前体形式变成活性形式时)；(2)正向调节细胞代谢过程(positive regulation of cellular metabolic process)，即单个细胞通过激活或增加化学反应和信号旁路的频率、速率或程度来改变化学物质的生物过程；(3)神经系统发育(nervous system development)，即神经组织从形成到成熟的生物过程。在细胞组分方面，其显著富集的最基础结构是细胞内细胞器组成部分(即细胞核、线粒体、质体、液泡、囊泡、核糖体和细胞骨架等的组成部分，但不包括质膜)和细胞内有界细胞器(即在细胞内的，有单或双层膜的，具有独特形态和功能的结构，包括细胞核、线粒体、质体、液泡和囊泡，不包括质膜)。从GO的解析来看，耐药相关的基因主要富集的旁路是RNA聚合酶II调控区序列特异性DNA结合旁路，主要通过正向调节发挥作用，位置主要是在细胞内有界细胞器上。

本研究利用芯片技术确定了化疗耐药相关的miRNAs,并通过RT-qPCR首次验证了miR-125-5p、miR-181c-5p和miR-153-3p在化疗耐药细胞中的异常表达。我们选取部分表达差异显著的miRNAs进行靶基因预测，并进行生物信息学分析，进一步确定了与化疗耐药密切相关的基因所在的细胞位置，涉及的生物过程，所用的信息通道，为进一步研究结肠癌化疗耐药提供了坚实的分子基础。