切应力通过Pim1/eNOS途径调节人脐静脉内皮细胞NO分泌*

张 敏，孙 玉，唐平静，张文君，王汉琴△

(湖北医药学院附属随州医院 1转化医学研究中心， 2麻醉科， 湖北 随州 441300； 3十堰市太和医院超声影像科， 湖北 十堰 442000)

一氧化氮(nitric oxide, NO)的产生由内皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)介导。蛋白激酶B(Akt)/eNOS通路是流体切应力调节内皮NO分泌的经典途径[1]。研究表明，切应力对eNOS的活化不仅可由Akt介导，也可以通过激活蛋白激酶A[2]、接头蛋白Gab1[3]及核心蛋白glypican-1[4]等而诱导eNOS的活化。

Pim(proviral integration of MMLV)家族是一组编码丝/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase)的原癌基因。血管内皮生长因子可通过Pim1诱导体外培养的血管内皮细胞eNOS磷酸化，在调节内皮细胞的血管生成中起作用[5]。Pim1和Akt同属丝/苏氨酸蛋白激酶，二者能够直接磷酸化相同底物共同调控细胞生长[6-7]。前期工作我们利用平行平板流动腔系统，显示Pim1对切应力敏感，动脉大小的层流切应力可以诱导其表达[8]。因此，我们提出这样一个假设，切应力是否也可以通过Pim1调节血管内皮细胞NO分泌？

本研究利用平行平板流动腔系统，对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)施加15 dyn/cm2层流切应力(laminar shear stress)后，检测Pim1基因的表达，探讨Pim1是否在切应力调节NO的分泌中起作用，从力学生物学角度了解血管eNOS/NO信号转导的途径。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

胎牛血清和M199培养基购自Gibco；EGMTM-2内皮细胞生长培养液(Lonza)购自Allendale；TRIzol购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自Thermo。SYBR Green Supermix购自Bio-Rad;兔抗Pim1多克隆抗体购自Millipore；兔抗eNOS和p-eNOS (Ser1177)多克隆抗体购自Cell Signaling Technology；小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自碧云天；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG和马抗小鼠IgG购自鼎国昌盛生物技术公司；LipofectamineTM3000购自Invitrogen;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。BioTek Epoch酶标仪；Bio-Rad荧光定量PCR仪(CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System);平行平板流动腔加载装置购自上海泉众机电科技有限公司。

2 方法

2.1HUVECs的培养及鉴定 取新鲜新生儿脐带(湖北医药学院附属随州医院产科提供，标本采集经过患者家属知情同意及医院伦理委员会通过)，根据脐带解剖结构找到脐静脉后用0.125%胰酶消化，注意让胰酶充分与血管内皮层接触，持续消化10 min，用含血清的培养基终止消化，低速离心细胞悬液，再将悬浮液接种在用0.1 g/L多聚赖氨酸包被的培养瓶中，EGMTM-2内皮细胞生长培养液培养，置于5% CO2、37 ℃培养箱中，1～2 d左右换液1次，大约7 d长至融合状态。胰酶消化后传代，免疫荧光鉴定，取第2～4代用于实验。

2.2流体切应力加载 平行平板流动腔系统用于流体切应力加载。该系统包括蠕动泵、储液瓶、管道及流室。流室流道高度0.03 cm、宽度2.4 cm。细胞沿中轴方向种植于7.5 cm×2.4 cm×0.01 cm(长×宽×高)、经过0.1g/L多聚赖氨酸包被的玻璃载玻片上。通过此装置，细胞可接受到稳定的层切应力刺激。采用τ=6μQ/wh2计算切应力强度。本实验通过调节恒流泵大小改变Q值，调整切应力强度以达到实验所需值。

2.4siRNA干扰实验 依据GenBank中人Pmi1基因全长cDNA序列，委托上海生工合成特异性靶向Pim1基因的siRNA片段。待HUVECs生长融合至80%时，用LipofectamineTM3000介导siRNA转染，实验方法按说明书进行，转染36 h后，real-time PCR检测。阴性对照RNA(scrambled siRNA，siScr)序列正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。筛选出最佳siPim1序列正义链为5’-GCCCUGAGACCAUCAGAUATT-3’，反义链为5’-UAUCUGAUGGUCUCAGGGCTT-3’。未转染组作为空白对照。

2.5实验分组 本实验切应力大小为15 dyn/cm2层流切应力，加载时间为15 min。实验分2组，切应力加载(shear)组和静止对照(static)组。HUVECs分别转染siScr和siPim1后，再移入平行平板流动腔，切应力加载组siScr+shear和 siPim1+shear为实验组，静止组siScr+static和siPim1+static为平行对照。

2.6RT-qPCR实验 采用TRIzol提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒获得cDNA。Real-time PCR检测Pim1表达，Pim1上游引物序列为5’-GCAAATAGCAGCCTTTCTGG-3’，下游引物序列为5’-CCTAGGACCCCTGGAGAGTC-3’；GAPDH上游引物序列为5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’，下游引物序列为5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’。每个样品设置3个复孔，反应总体系为20 μL，PCR条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，61.4 ℃ 30 s，40个循环。GAPDH作为内参照，用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。

2.7Western blot检测 各组HUVECs用PBS清洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的1×loading buffer，超声波粉碎细胞后变性备用；用12%的SDS-PAGE，转膜后用5%BSA室温封闭2 h；Ⅰ抗(抗Pim1、eNOS、p-eNOS (Ser1177)和GAPDH抗体，1∶1 000比例稀释)4 ℃摇床孵育过夜；Ⅱ抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG和碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG，1∶800比例稀释)，室温孵育2 h；TBST清洗膜后加入NBT/BCIP显色液显色。以GAPDH作为内参照。

3 统计学处理

数据以均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0进行统计分析。两组间均数比较采用Student’st检验;多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 切应力对HUVECs中Pim1表达和NO分泌的影响

Western blot结果显示，与static组相比，shear组HUVECs中Pim1蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图1A。NO分泌检测结果显示，shear组HUVECs NO的分泌量也显著高于static组(P<0.05)，见图1B。

Figure 1. Shear stress increased Pim1 expression (A) and NO release (B) in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
图1 切应力诱导HUVECs中 Pim1表达及NO分泌

2 切应力对HUVECs中eNOS 磷酸化的影响

Western blot结果显示，与静止对照组相比较，切应力作用5 min，磷酸化eNOS-Ser1177水平即显著增高(P<0.05)，而且可以持续到30 min，见图2。

Figure 2. Shear stress induced phosphorylation of eNOS at Ser1177 in HUVECs. Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
图2 切应力诱导HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化

3 siPim1转染对切应力诱导的Pim1表达的影响

HUVECs分别转染siPim1和siScr后，RT-qPCR检测Pim1 mRNA表达水平，评估siPim1的抑制效果，结果显示，未转染组和siScr组Pim1 mRNA表达无差异，而siPim1组Pim1 mRNA表达水平显著低于siScr组(P<0.05)，见图3A。将转染后的细胞移入平行平板流动腔，Western blot结果表明，与siScr+static组比较，siScr+shear组Pim1蛋白表达显著增加(P<0.05)；而与siScr+shear组比较，siPim1+shear组Pim1蛋白表达显著被抑制(P<0.05)，见图3B。

Figure 3.Pim1knockdown inhibited shear stress-induced Pim1 expression in HUVECs. A: the mRNA expression le-vel of Pim1; B: the protein level of Pim1 was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssiScr group;*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear.
图3 沉默Pim1抑制切应力诱导的Pim1表达

4 siPim1转染对切应力诱导的HUVECs eNOS磷酸化和NO分泌的影响

Western blot及NO分泌检测显示，与siScr+static组比较，siScr+shear组HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都显著增加(P<0.05)；而与siScr+shear组比较，siPim1+shear组HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都显著被抑制(P<0.05),见图4。

Figure 4.Pim1silencing attenuates phosphorylation of eNOS at Ser1177 and NO production in HUVECs. A: Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels; B: NO in cell culture medium was determined. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear group.
图4 沉默Pim1抑制切应力诱导的eNOS磷酸化及NO产生

讨 论

流体切应力是作用于血管内皮细胞最直接的一种力学刺激，在动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。人动脉平均切应力大小在10 dyn/cm2～30 dyn/cm2之间，这种强度的切应力作用于血管内膜，可以刺激内皮细胞抗动脉粥样硬化(anti-atherogenic)基因的表达，促进NO产生，使内膜保持抗动脉粥样硬化表型[9]。本研究选择15 dyn/cm2的层流切应力，观察到在短时相15 min，HUVECs的Pim1蛋白表达就显著上调。研究报道，血管内皮生长因子孵育HUVECs 20 min就显著上调Pim1 mRNA表达水平[10]。我们用血小板源性生长因子刺激血管平滑肌细胞，在30 min时点，也观察到Pim1 mRNA表达水平显著上调[11]。这些结果可能和Pim1属于“立早反应(immediate early response)”基因有关[12]。可能是细胞类型不一样，刺激方式不一样，Pim1表达发生改变的时间点有差别。

Pim1蛋白在结构上缺乏调节亚基，Pim1功能被认为与其表达量相一致[13]。本实验我们首先检测到加载切应力可上调Pim1蛋白表达，同时HUVECs的NO分泌量也升高，这提示Pim1可能在NO的分泌调节中起作用。为了进一步验证这个假设，用小干扰RNA转染HUVECs敲低Pim1表达，结果显示切应力上调的Pim1 蛋白表达也被抑制，同时NO分泌平行降低。为此，我们初步认为在切应力作用下Pim1参与调节血管内皮细胞 NO分泌。

Dimmeler 等[1]在1999年首先发现切应力通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路激活eNOS 在丝氨酸第1 177 位点的磷酸化，增加血管内皮细胞NO合成和分泌。因此，我们还需要探讨Pim1是否可以和Akt一样，通过eNOS-Ser1177途径调节NO产生。我们先重复了已有的研究，观察了在切应力作用下HUVECs中的eNOS磷酸化水平，也证实切应力可以持续激活HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化。然后，敲减HUVECs中Pim1表达，结果eNOS-Ser1177磷酸化也被抑制。这就说明切应力可能通过Pim1调节eNOS活性。当然，Pim1与Akt之间是否存在相互联系，相关实验仍在进行中。

综上所述，切应力可短时相内增加HUVECs Pim1表达水平，同时伴随eNOS-Ser1177磷酸化水平增加和NO的分泌增加。本研究初步证实了Pim1可通过eNOS信号参与切应力调节血管内皮细胞NO分泌，这可能是切应力调控内皮细胞NO分泌的信号途径之一，但还需要更多研究进一步证实。