付 蓓,贺惠娟
(湖北中医药大学, 湖北 武汉 430065)
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,每年约有180万人因肺癌死亡[1]。依照组织病理学分类,肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌[2],其中非小细胞肺癌占大多数,约85%左右。非小细胞肺癌包括肺腺癌和肺鳞癌,有资料表明,肺腺癌发病率增长迅速[3]。外科手术是目前早期肺腺癌治疗的首选方式,尽管如此,由于早期发病隐蔽,不易诊断,一旦发现已到中晚期并可能伴有转移,导致其病死率高。因此,亟需深入研究肺腺癌的发病机制,寻找高敏感性和特异性的肿瘤标志物,以期为早期诊断和防治及预后判断提供更为可靠依据。高迁移率族蛋白B2(high-mobility group protein B2,HMGB2)是HMG蛋白家族成员之一,研究发现它与许多肿瘤的发生发展有关[4-5]。但目前HMGB2在肺腺癌中的作用尚无报道,本研究基于肿瘤网络数据库探究HMGB2在肺腺癌中的表达及其与细胞功能状态和预后的关系,并进一步探究其在肺腺癌发生中的可能作用机制。
采用Cancer RNA-Seq Nexus (CRN)数据库(http://syslab4.nchu.edu.tw)分析肺腺癌组织HMGB2表达情况;采用OncoLnc数据库(http://www.oncolnc.org)分析HMGB2表达与肺腺癌或肺鳞癌预后的相关性;采用COX回归法进行高/低表达组生存分析,该数据库肺癌资料均来源于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库;采用肿瘤单细胞数据库(http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)分析HMGB2基因表达与癌细胞14种功能状态的相关性,并进一步分析HMGB2基因表达与肺腺癌细胞功能状态的相关性。
人肺腺癌A549细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清、DMEM高糖培养基、PBS缓冲液、胰酶和青链霉素双抗购自Gibco;PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB Green® Premix Ex TaqTM购自大连宝生物公司;CCK8检测试剂盒购自上海东仁科技公司;HMGB2引物序列引物由上海生工生物工程公司合成;靶向HMGB2的siRNA和riboFECT CP Transfection Kit购自广州锐博生物公司;抗HMGB2抗体购自Abcam。CO2培养箱为Thermo产品;荧光定量PCR仪为ABI产品;荧光显微镜为Olympus产品;酶标仪为BioTek产品;蛋白电泳分离、转膜和成像系统为Bio-Rad产品。
3.1细胞培养和转染 A549细胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基,培养条件为37℃、5%CO2,细胞生长至80%左右融合度时传代,取状态良好的对数生长期细胞进行实验研究。取对数生长期的A549细胞分为对照(control)组、NC-siRNA组和HMGB2-siRNA组,按照riboFECT CP Transfection Kit说明书步骤进行细胞转染操作,采用real-time PCR和Western blot检测HMGB2水平来评价转染效率。
3.2Real-time PCR和Western blot检测A549细胞HMGB2的表达 将A549细胞按每孔5×105个接种于6孔板,依照不同分组进行实验处理,48 h后用TRIzol裂解液提取总RNA,操作按试剂说明书进行,再用PrimeScriptTMRT reagent Kit将RNA逆转成cDNA,操作按试剂盒说明书进行。用TB Green® Premix Ex TaqTM进行检测,real-time PCR 程序为 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共40个循环。引物由上海生工生物公司合成,引物序列见表1。以GAPDH为内参照,采用2-ΔΔCT法对HMGB2 mRNA表达进行相对定量分析[6]。
表1 Real-time PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time PCR
将A549细胞按每孔5×105个接种于6孔板,依照不同分组进行实验处理,48 h后用RIPA裂解液收集细胞总蛋白,BCA定量后煮沸蛋白变性。取30 μg总蛋白,10%的SDS-PAGE胶分离蛋白后转膜至PVDF膜,脱脂奶粉封闭1 h后,HMGB2抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,II 抗(1 ∶5 000)室温避光孵育1 h,TBST洗膜3次,ECL化学发光后成像系统进行图像采集及灰度分析。
3.3CCK8和EdU实验检测A549细胞增殖 将A549细胞按每孔5×103个接种于96孔板,依照不同分组进行实验处理,48 h后每孔加入10 μL的CCK8试剂,37 ℃孵育2 h后通过酶标仪测定450 nm的吸光度(A)值。将A549细胞按每孔5×105个接种于6孔板,依照不同分组进行实验处理,48 h后每孔加入1 mL 50 μmol/L EdU培养基,37 ℃孵育2 h,PBS清洗后多聚甲醛固定,细胞破膜后Apollo染色和DAPI染核30 min,PBS清洗后荧光显微镜下观察拍照。
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5软件进行数据处理和图片绘制,数据用均数±标准差(mean±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),其中两两比较选择Bonferroni校正的t检验进行,以P<0.05代表差异有统计学意义。
采用CRN数据库分析肺腺癌组织HMGB2表达情况,结果显示,肺腺癌组织中HMGB2表达较正常肺组织高,依照肿瘤分期不同,正常、ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期、ⅢA期、ⅢB期和Ⅳ期的HMGB2表达的TPM均数分别为41.67、70.96、89.24、90.35、94.54、80.26、93.94和107.0,见图1。
Figure 1.HMGB2gene expression in lung adenocarcinoma tissues.
图1 肺腺癌组织HMGB2基因表达
利用OncoLnc数据库分别分析HMGB2表达与肺腺癌或肺鳞癌预后的相关性,结果显示,肺腺癌患者中,HMGB2高表达组患者总生存期明显低于HMGB2低表达患者(log-rank检验P=0.0173);而肺鳞癌患者中,HMGB2高表达组患者总生存期与HMGB2低表达患者无明显差异(log-rank检验P=0.142),见图2。
利用CancerSEA网站分析HMGB2与恶性肿瘤细胞14种功能状态的相关性,结果显示,HMGB2表达与细胞多种功能状态相关,其中与细胞周期和增殖呈正相关,见图3。我们进一步对于HMGB2与2项肺腺癌(LUAD)细胞功能状态的相关性进行分析,该肺腺癌数据来源于2个不同研究[Kim KT. Genome Biol. 2015;Guillaumet-Adkins A. Genome Biol. 2017],癌细胞数量分别为126个和42个。结果显示,HMGB2表达与肺腺癌细胞周期和增殖呈正相关,2个肺腺癌数据的相关系数分别为0.825/0.740和0.673/0.643,见图4。
Figure 2. Relationship betweenHMGB2gene expression and prognosis of the patients with lung adenocarcinoma (LUAD) and squamous-cell carcinoma (LUSC).
图2HMGB2基因表达与肺腺癌/肺鳞癌患者预后关系
通过siRNA转染敲减A549细胞HMGB2的表达,并验证沉默效果,结果显示,与对照组相比,NC-siRNA组HMGB2的mRNA和蛋白表达均无明显差异(P>0.05);而与NC-siRNA组相比,HMGB2-siRNA组HMGB2的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),见图5。
通过CCK8和EdU实验检测A549细胞的增殖情况,结果显示,与对照组相比,NC-siRNA组的细胞活力和增殖能力无明显差异(P>0.05);而与NC-siRNA组相比,HMGB2-siRNA组的细胞活力和增殖能力显著降低(P<0.05),见图6。
肺腺癌是最常见的肺癌类型,约占肺癌的40%,其从小气道上皮II型肺泡细胞转化发展而来,能够分泌黏液和其他物质[7]。肺腺癌是一种恶性程度和致死率高的肿瘤类型,中晚期患者总生存率往往不超过5年。有鉴于此,亟需探究肺腺癌发生发展的分子机制,有助于探寻早期肺腺癌防诊治和预后的分子靶标。
高迁移率族蛋白是一种广泛存在于真核细胞内的染色质蛋白质,其家族成员包括HMGB1~4,在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中发挥着重要作用[8]。其中HMGB1是研究最为广泛的成员,其首先被发现作为晚期炎症介质在脓毒症中发挥作用[9]。HMGB1在组织损伤后释放并激活机体免疫系统,与许多风湿免疫性疾病密切相关[10]。研究报道HMGB1可以通过多种信号通路参与肿瘤的进展,迄今为止,世界各地的不同研究团队已报道了HMGB1在肝、肺、乳腺、结肠直肠、前列腺、宫颈和卵巢肿瘤中发挥作用[11]。HMGB家族成员结构上高度同源,鉴于此,HMGB2是否与肿瘤的发生发展相关也受到研究者的关注,有报道表明其与一些肿瘤的发生关系密切。Cui等[5]研究发现HMGB2能促进胃癌的恶性程度及不良预后;石小康等[12]发现HMGB2高表达与肝癌患者临床病理及预后显著相关。但HMGB2在肺腺癌中的作用和具体机制目前尚不清楚,有待进一步深入研究。
Figure 3. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in different malignant tumor cells.
图3 不同恶性肿瘤细胞HMGB2基因表达与癌细胞功能状态的相关性
Figure 4. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in lung adenocarcinoma cells.
图4 肺腺癌细胞HMGB2基因表达与癌细胞功能状态的相关性
Figure 5. The silencing effect of siRNA onHMGB2expression in human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the results of real-time PCR; B: the images and the quantitatative analysis of Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
图5 siRNA对人肺腺癌A549细胞HMGB2的沉默效果
Figure 6. Effect of HMGB2 on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the quantitatative analysis of CCK8 assay; B: the images and the quantitatative analysis of the EdU assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
图6 HMGB2对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
本文通过肿瘤基因表达谱数据分析发现HMGB2在肺腺癌中高表达,再利用最新的单细胞数据库显示HMGB2基因表达与肺腺癌细胞周期和增殖呈密切的正相关关系,同时HMGB2高表达组患者总生存期明显低于HMGB2低表达患者。提示HMGB2高表达可通过细胞周期调控增殖,参与肺腺癌的发生发展。真核细胞通过调控细胞周期维持机体的正常代谢和增殖,细胞周期调控的改变能使得细胞增殖能力增强,异常增殖的肿瘤细胞是其发生的病理生理基础,因此,细胞周期和增殖相关调控信号机制成为抗肿瘤研究的热点[13]。本研究进一步在肺腺癌A549水平验证了HMGB2对增殖的调控,利用siRNA沉默HMGB2表达后,A549细胞增殖能力减弱,提示HMGB2确实能参与肺腺癌细胞增殖的调控。刘爱蕙等[14]通过沉默HMGB2基因也发现可显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖;Kwon等[15]使用siRNA沉默肝癌细胞HMGB2后证实可以有效抑制细胞的增殖和克隆形成。这些证据和我们的研究结果一致,均表明HMGB2在肺腺癌等恶性肿瘤细胞的增殖中起着关键作用。
本文利用肿瘤生物信息学网络分析了HMGB2在肺腺癌组织中高表达及与患者预后关系密切,发现HMGB2与肺腺癌细胞周期和增殖呈现正相关;进一步在肺腺癌A549细胞水平上抑制HMGB2表达,证实其对细胞活力和增殖的调控。这提示HMGB2可以作为潜在的评估肺腺癌患者预后的标志物和治疗靶标,为肺腺癌的防治提供新思路。